GRAFIX

Titlu proiect : Produs furajer pentru diminuarea contaminarii cu micotoxine la porc

Acronim : GRAFIX

Support financiar : UEFISCDI

COD Proiect: PN-III-P2-2.1-PED-2016-1255

Contract nr. 189

 

REZUMAT

Proiectul de fata este focusat pe cercetari privind calitatea si siguranta hranei, si are ca scop investigarea de noi solutii naturale bazate pe reciclarea reziduurilor vinicole pentru reducerea riscului contaminarii cu micotoxine a hranei animale si umane.

Proiectul se incadreaza in nivelul 2 (TRL2) si 3 (TRL3) al Technology Readiness Level si include doua componente: 1) rezultate preliminare obtinute de echipa proiectului privind efectul micotoxinelor sau al reziduurilor vinicole pe de o parte si 2) rezultate din literatura raportate de Avantaggiato et al., (2014) care a aratat ca borhotul de vin a adsorbit micotoxine ca aflatoxina B1 si zearalenona in mediu de cultura in vitro. Aceste doua componente separate vor constitui punctul de plecare (TRL2), iar interactiune lor si studiile analitice de laborator urmatoare vor constitui baza catre TRL3.

Proiectul are patru faze si noua activitati. Modele experimentale optimizate in laboratorul echipei vor fi folosite pentru studiile in vitro (faza 2) in care capacitatea extractului rezidual de a adsorbi si reduce efectele produse de toxine va fi investigata in culturi de celule intestinale (prima bariera a organismului expus la intoxicatii) si hepatice (cel mai important site al biotrasformarii xenobiotice). Studii comparative vor fi efectuate.

Faza a -3 a proiectului va fi focusata pe studii in vivo. Experimentele vor fi realizate pe porc si vor investiga capacitatea noului produsului furajer de a adsorbi micotoxinele din hrana contaminata si diminua efectele negative produse de acestea.

Rezultatele noi obtinute in proiect vor contribui la : i) dezvoltarea de solutii naturale (produs furajer cu proprietati decontaminante), ii) reciclarea reziduurilor vinicole rezultate din procesarea industriala a vinului, iii) cunoasterea mecanismelor moleculare produse de compusii bioactivi din reziduuri, iv) furnizarea de date pentru stabilirea de reglementari si norme alimentare privind nivelurile de toleranta pentru micotoxine.

 

Obiectivul general al proiectului. Bazandu-ne pe datele de literatura (TLR-1) si pe studii realizate in laboratorul de biologie animala, INCBNA-IBNA, (TLR3-4), obiectivul general al proiectului PED/189 a constat in investigarea si dezvoltarea de noi solutii naturale (produs furajer) bazate pe reciclarea reziduurilor vinicole bogate in compusi bioactivi cu potential pentru reducerea riscului contaminarii cu micotoxine a hranei animale.

Proiectul s-a incadrat in nivelul 1-2 (TRL1-2) si 3-4 (TRL3-4) de dezvoltare tehnologica (Technology Readiness Level) si a avut doua faze cu 12 activitati si s-a derulat pe o perioada de 1 an si 3 luni (17 august 2017-5 decembrie 2018).

Contextul proiectului. Micotoxinele sunt toxine produse de fungi a caror prezenta este regulat raportata in diferitele surse de hrana animala sau umana. Detoxifierea acestora este foarte importanta vederea protejarii sanatatii animalelor si oamenilor, iar abordarile biologice sunt din ce in ce mai promitatoare. Multi aditivi sunt comercializati si utilizati in hrana animalelor de ferma de catre fermieri. Majoritatea au dovedit o buna eficienta in adsorbtia unor micotoxine in stidii in vitro, dar mai putine studii au investigat eficeinta lor si in vivo. Studii sunt inca necesare pentru a demonstra eficacitatea acestora si a explica mecanismul lor de actiune.

Reziduurile provenite din industria agroalimentară reprezintă surse importante de compuși bioactivi (polifenoli, acizi grași polinesaturați-PUFA, fibre, vitamine, minerale etc) care ar putea fi utilizate pentru reducerea toxicitatii contaminantilor din hrana animala prin adsorbție fizică directă sau prin alte mecanisme (biotransformare / imunostimulare). Cercetari realizate de Shar et la,, (2016), Gambacorta et al., (2016), Gutzwiller et al., (2007), au demonstrat eficienta unor reziduuri de mar, coaja de banana, borhot de struguri etc de a diminua absorbtia la nivel gastrointestinal a unor micotoxine ca deoxinivalenol, fumonisine, ochratoxina, aflatoxine si de a contracara efectele lor negative. Studii recente realizate de Avantaggiato și colab., (2014) au arătat că reziduurile vinicole reduc concentrația de contaminanți din furaje (micotoxine) în urma unui proces de adsorbție in mediu lichid. Pe de altă parte, prin conținutul bogat în antioxidanți (polifenoli, PUFA etc,), acestea ar putea stimula capacitatea de apărare a organismului de a răspunde la acțiunea agresivă a contaminanților.

 

Obiectivele specifice prevăzute si realizate:

O1.Caracterizarea analitica a unor subproduse/reziduri vinicole in vederea utilizarii lor ca agenti de diminuare a efectelor negative produse de aflatoxina B1; selectarea subprodusului cel mai bogat in compusi bioactivi. Nivel de maturitate tehnologica atins: TLR2-3 (TLR2-3);

O2.Formularea unei retete de produs furajer incluzand reziduul vinicol selectat pe baza compozitiei chimice si a cerintelor nutritionale pentru purcei după intarcare. Nivel de maturitate tehnologica atins: TLR2-3 (TLR2-3);

O3.Investigarea in teste experimentale in vivo a capacitatii produsului furajer de a contracara efectele negative produse de micotoxine (aflatoxina B1), la purcei dupa intarcare (nivel TLR4).

O4.Recomandare nutritionala vizand includerea in rețetelor de nutreț combinat destinate purceilor dupa intarcare reziduurilor vinicole eficiente in reducerea efectelor negative si pierderilor economice cauzate de contaminarea cu micotoxine.

 

ECHIPA DE CERCETARE

1. Ionelia Taranu, coordinator proiect
2. Daniela Marin, membru in echipa
3. Gina-Cecilia Pistol, membru in echipa
4. Mihai Palade, membru in echipa
5. Iulian Gras. membru in echipa
6. Veronica Sanda Chedea, membru in echipa
7. Mariana Stancu, technician
8. Georgeta-Loredana Calin, asistent
9. Claudia Dragomir, membru in echipa

 

Etapele proiectului:

Etapa nr.	Titlu etapa	Perioada
1	Etapa 1-Reactualizarea conceptului si studii analitice (TRL1-TLR2)	2017
1.1	Activitatea 1.1: Screening al literaturii de specialitate si a altor referinte pentru reactualizarea suportului stiintific si identificarea principiilor pe care se bazeaza ipoteza utilizarii reziduurilor vinicole ca alternative la adsorbantii comerciali antifungici si antimicotoxici.
1.2	Activitatea 1.2: Clasificarea diferitelor tipuri de reziduuri vinicole in functie de continutul in compusi bioactivi pe baza tabelelor de compozitie chimica feedipedia.
1.3	Activitatea 1.3: Selectionare reziduu; contactare de IMM-uri care prelucreaza reziduuri; achizitionare reziduu si ingrediente pentru obtinerea produsului de uz furajer.
1.4	Activitate 1.4: Studii analitice pentru determinarea compozitiei chimice brute a reziduului vinicol selectionat utilizand echipamente specifice.
1.5	Activitate 1.5: Studii analitice pentru determinarea compozitiei in compusi bioactivi (polifenoli, acizi grasi, minerale etc) a reziduului vinicol selectionat utilizand echipamente analitice performante (LC-MS, GS-MS, absorbtie atomica).
1.6	Activitate 1.6: Studii analitice pentru determinarea gradului de contaminare fungica si micotoxicaa reziduului vinicol selectionat
2	Etapa 2: Experimentare analitica de laborator (TRL3); Experimentare in vivo la nivel de ferma (ferma zootehnica Victoria) pentru investigarea potentialului antifungic si antimicotoxic al produsului de uz furajer continand reziduu vinicol selectionat (TRL4)	2018
2.1	Activitate 2.1: prelucrare/pregatire reziduu in vederea optimizarii lui ca ingredient furajer: teste de macinare cu diferite tipuri de site si diferiti timpi pentru optimizarea marimii particulelor; teste de premixare si mixare a reziduului cu celelalte elemente / ingrediente ale produsului; omogenizarea si fabricare produs finit.
2.2	Activitatea 2.2: Teste analitice pentru determinarea compozitiei chimice brute si a compusilor bioactivi din ingredientele utilizate pentru obtinerea produsului furajer si din produsul furaj finit; teste analitice de verificare a gradului de prezervare a activitatii compusilor bioactivi din produs (ex. DPPH, TBARS, etc).
2.3	Activitate 2.3: Elaborare recepturi experimentale; fabricare retete de nutret combinat cu reziduu, contaminare produs furajer cu micotoxina, experimentare in vivo, pregatire loturi de animale, supravegherea desfãsurarii experimentului in vivo.
2.4	Activitate 2.4: Determinare parametri de crestere; sacrificare animale; prelevare probe biologice (sange, organe).
2.5	Activitate 2.5: Studii analitice pentru determinarea raspunsului in vivo sistemic (parametri biochimici, histologici si imunologici) din sângele animalelor din experiment.
2.6	Activitate 2.6: Studii analitice pentru determinarea raspunsului in vivo la nivel local (parametri biochimici, histologici si imunologici) din organele imune (splina, ganglioni mezenterici, intestin).

 

Rezultate sintetice obtinute in etapa 1 (17.08-5.12.2017):

In cadrul primei etape a proiectului s-a efectuat un screening al literaturii de specialitate privind utilizarea reziduurilor agro-alimentare ca decontaminanti ai micotoxinelor si eficenta acestora. astfel, studiile realizate de Shar et al., (2016), Gambacorta et al., (2016), Gutzwiller et al., (2007), etc au demonstrat eficienta unor reziduuri de mar, coaja de banana, borhot de struguri etc in diminuarea absorbtiei la nivel gastrointestinal a unor micotoxine ca deoxinivalenol, fumonisine, ochratoxina, aflatoxine si de a contracara efectele lor negative. Studii recente realizate de Avantaggiato și al., (2014) au arătat că reziduurile vinicole reduc concentrația de contaminanți din furaje (micotoxine) în urma unui proces de adsorbție in mediu lichid.

Pornind de la aceste rezultate a fost formulata ipoteza proiectului potrivit careia conținutul bogat în substante bioactive (polifenoli, PUFA, fibre etc), al reziduurilor vinicole ar putea imbunatati/stimula capacitatea de apărare a organismului de a răspunde la acțiunea agresivă a contaminanților.

Datele de literatura au aratat de asemenea ca sunt necesare studii suplimentare mai ales in vivo, multe dintre studii fiind efectuate in vitro, pentru a confirma potentialul si eficacitatea lor la diferite animale de ferma.

Enciclopedia on-line Feedipedia clasifica reziduurile vinicole dupa cum urmeaza:

• Borhot de struguri sau tescovina este reziduul vinicol compus din pulpa si coji (40%), samburi (30%) si uneori tulpini (30%), Cand nu contine tulpini continutul este aproximativ 40% samburi si 60% pulpa si coji.
• Srot sau turte de semninte de struguri care se obtine dupa p[extractia uleiului din seminte. Srotul sau turtele de samburi de struguri sunt o sursa importanta de acizi polinesaturati (64-75%) dintre care acidul linoleic (omega-6) urmat de acidul oleic (omega-9) sunt in concetratia cea mai mare, Semintele contin de asemenea concetratii importante de polifenoli (5-8%), mai ales flavonoide. Flavonoizii sunt recunoscuti ca antioxidanti cu efecte pozitive in prevenirea stresului oxidativ prin reducerea peroxidari lipidice si blocarea producerii de radicali liberi,
• Frunze si tulpini/tije/corzi de vita de vie sunt sarace in proteine, dar ca si celelalte reziduuri vincole sun bogate in fibre, frunzele avand un continut mai mare proteic decat tijele (7-14% vs 3-7%) si mai mic de fibre (18-39% vs 25-57%), tijele sunt bogate mai ales in lignina (10-25%) care creste in timpul depozitarii.

Plecand de la datele de literatura in laboratorul nostru au fost analizate si caracterizate probe de reziduuri vinicole (borhot/tescovina, srot de samburi si turte de samburi de stuguri) romanesti din punct de vedere al compozitiei chimice bruta si compozitiei in compusi bioactivi. Similar cu datele din literatura, rezultatele noastre au demonstrat ca tescovina derivata din struguri romanesti nu are o concentratie mare de proteina, aceasta fiind influentata de podgorie si de soiul de struguri; continutul cel mai mare in proteina a fost inregistrat de tescovina provenita din struguri negri din podgoriile Pietroasele si Valea Calugareasca (10,44 si respectiv 10,65%), iar cea mai mica a fost obtinuta pentru tescovina provenita din struguri albi-Ceasla Vrancea (5,0%). Tescovina de Pietroasele si Valea Calugareasca are de asemenea concentratia cea mai mare de fibre (23,47 si 27,13%) si de minerale (5,92, 6,13 si 5,75%).

Comparativ, turtele si srotul de samburi/seminte de struguri au un continut mult mai mare fibre (40,66 si respectiv 37,76%) si o concentratie de proteina usor mai mare decat a tescovinei.

Feedipedia nu contine date referitoare la compozitia in compusi bioactivi ai reziduurilor vinicole Analiza HPLC-MS efectuata in cadrul proiectului a aratat ca ambele reziduuri (tescovina si srotul de seminte de struguri) sunt bogate in compusi bioactivi de tipul polifenolilor din grupa flavanoidelor (flavanoli- catechine, epicatechine, gallocatechine, epigallocatechine, procyanidine) si antociani (Petunidin 3-O-glucoside, Malvidin 3-O-glucoside). Pentru srot de samburi cele mai mari concentratii s-au inregistrat pentru isorhamnetine 3-O-glucoside (56,60mg/100g), catechine (48,93mg/100g) and epicatechin (48,23mg/100g), iar pentru tescovina cea mai mare concentratie s-a inregistrat pentru epicatechine (51,96g/100g) urmata de procianidine (22,79g/100g) si catechine (11,63g/100g).

Reziduurile vinicole sunt surse foarte bogate in compusi bioactivi de tipul acizilor grasi polinesaturati in special omega -6. Cea mai mare concentratie de acid linoleic s-a inregistrat pentru srot 62.94% comparativ cu borhotul pentru care concentratiile de acid linoleic au variat intre 49,76 si 58,99 %. Acidul oleic (omega-9) a fost al doilea acid gras in concentrarie semnificativa variind intre 16,86 si 21,45% pentru tescovina si intre 15,30 si 17,05% pentru srotul de seminte.

Caracterizarile analitice au pus in evidenta o compozitie chimica superioara (nivel mai mare de fibre, proteina si compusi bioactivi) pentru srotul de seminte de struguri care a fost selecat pentru evaluarea potentialului sau de a reduce efectele negative produse de un furaj contaminat cu micotoxine.

 

Indicatori de rezultate pentru etapa 1:

Rapoarte de incercare (buletine de analiza) cu valori de compozitie chimica a unor reziduuri vinicole.

 

Rezultate sintetice obtinute in etapa 2 (6.12.2017-5.12.2018):

Etapa a doua a proiectului PED/189 s-a incadrat in nivelul 3 si 4 de TLR si a inclus conform acestor niveluri:

1) studii/activitati analitice de laborator pentru validarea in concordanta cu ipoteza proiectului a componentelor/elementelor separate (TLR-3) si

2) teste de nutritie pentru validarea componentelor și/sau a ansamblului în condiții de laborator (TLR-4).

1) studii/activitati analitice de laborator pentru validarea in concordanta cu ipoteza proiecutlui a componentelor/elementelor separate (TLR-3)

Conform analizelor biochimice efectuate, srotul de seminte de struguri nu are un continut mare de proteina (11,45%), conform datelor de literatura concetratia proteica fiind influentata de podgorie si de soiul de struguri. In contrast, srotul de samburi de struguri are un continut mult mai mare fibre (37,76%). Teste analitice au fost efectuate in continuare pentru completarea caracterizarii chimice a srotului. Analiza HPLC-MS prezentata in raportul stiintific al etapei 2 a arătat prezența în extractul de srot de semințe de struguri a 24 tipuri diferite de compuși polifenolici. Dintre acestia, cea mai mare pondere o au acidul caffeoylquinic (57,36g), acidul ferulic (34,44g), acidul dicaffeoylquinic (28,85g), epigalocatechinele (22,28g), malvidin coumaroil glucoside (20,37g), etc. Printre compusii bioactivi care se afla in concentratii semnificative in struguri si reziduurile vinicole printre care si srotul de seminte se numara acizii polinesaturati (PUFA). Analiza cromatografica a pus in evindenta o concentratie mare (63.63 g%g) de acizi grasi polinesaturati omega -6 (n-6), cea mai importanta fiind inregistrata pentru acidul linoleic cis (62.94g %g).

Folosind analiza chimica bruta a ingredientelor furajere selectionate au fost formulate patru retete de nutret combinat experimental conform cerintelor NRC (2012) pentru tineret porcin care au fost fabricate in statia pilot a IBNA si folosite in testele de nutritie efectuate in cadrul proiectului.

Astfel, pe baza compozitiei chimice efectuate si in concordanta cu scopul proiectului srotul de seminte de struguri a fost inglobat intr-un procent de 8% in produsul furajer (nutretul combinat dedicat purceilor dupa intarcare). Acest furaj a fost caracterizat din punct de vedere analitic. Rezultatele au aratat ca furajul cu 8% srot de seminte de struguri este mai bogat compusi bioactivi avand concentratii mari de polifenoli ca acidul ferulic (116,54 mg %g) si acidul caffeoilquinic (173,43 mg%g), comparativ cu furajul control. Polifenoli cum sunt catechinele, epigalocatechine, procianidine, malvidin coumaroyl-glucoside, petunidin 3-O-glucoside au fost prezenti in concentratii substantiale doar in NC cu 8% srot comparativ cu NC control. Furajul cu srot a fost mai bogat in acizi grasi nesaturati (80,77 g%g vs 76,72) dintre care polinesaturati (52,01 mg%g vs 47,58g%g) ceea ce a dus la scaderea raportului de acizi grasi saturati / acizi grasi polinesaturati de la 0.298 la 0.234. Capcitatea antioxidanta a acestui furaj a fost de asemenea mai mare decat cea a furajului control (907,07 vs 308,81 μM Trolox echivalent).

2) teste de nutritie pentru validarea componentelor și/sau a ansamblului în condiții de laborator(TRL 4).

Experimentul in vivo prevazut pentru etapa a 2 a fost realizat in ferma experimentala a IBNA pe 24 de purcei hibrizi TOPIG intarcati (6 purcei/lot). O parte din NC control si NC cu 8% srot a fost contamiant artifical cu 320 ppb aflatoxina B1. Animalele au fost repartizate in patru loturi si au primit urmatoarele tratamente:

-lot 1: NC control (Control)

-lot 2: NC contaminat cu 320 ppb AFB1 (AFB1)

-lot 3: NC cu 8% srot de seminte de struguri (NC+SS)

-Lot 4: NC cu 8% srot de seminte de struguri contaminat cu 320ppb AFB1 (NC+SS+AFB1).

 

Rezultate sintetice obtinute in studiile in vivo:

Studii analitice pentru determinarea raspunsului in vivo sistemic (parametri biochimici si imunologici) din sângele animalelor din experiment (TLR-3).

Efectul AFB1 si furajului cu srot asupra performantelor. Cum era de asteptat purceii hraniti cu furaj contaminat cu AFB1 au inregistrat o scadere semnificativa (P<0.05) a performantelor de crestere comparativ cu purceii din lotul control si cei hraniti cu furaj contaminat, dar continand 8% srot, greutatea si sporul acestora creascand cu 13,1 si respectiv 27,9% (Tabel 10) fata de performantele purceilor intoxicati.

Efectul AFB1 si furajului cu srot asupra raspunsului in vivo la nivel sistemic (parametri biochimici si imunologici) in sange. Ingerarea aflatoxinei B1 in concentratia administrata (320 ppb) nu a influentat parametri biochimici sanguini care reflecta functionalitatea ficatului si a altor procese metabolice. Furajul cu srot necontaminat (Lot 3) a avut un efect reducator asupra concentratiei de colesterol total (64,59 mg/dl NC+srot vs 79,66 mg/dl NC control si 80,79 mg/dl NC+AFB1) ceea ce confirma datele din literatura care au pus in evidente potentialul hipoglicemiant si hipocolesterolic al compusilor biaoctivi (in special polifenoli) din reziduurile de struguri. De asemenea contaminarea cu AFB1 sau furajul cu 8% srot de seminte de struguri nu a produs efecte notabile asupra unor parametri imuni determinati la nivel sistemic, concentratia de imunoglobuline IgM, IgG si IgA sanguine fiind similare intre cele 4 loturi experimentale.

Efectul AFB1 si furajului cu srot asupra statusului antioxidant in sange. AFB1 este recunoscuta ca un inductor puternic al stresului oxidativ. Intradevar in plasma purceilor care au primit hrana contaminata cu AFB1 activitatea enzimelor antioxidante de faza 2 (catalaza-CAT, glutation peroxidaza-GPx, superoxid dismutaza-SOD), precum si capacitatea antioxidanta totala a scazut seminificativ. Administrarea de furaj cu 8% srot a carui activitate antioxidanta este mare a condus la o ameliorare semnificativa a acestor parametri (capacitate antioxidanta : 0,338- control, 0,277-AFB1, 0,429-srot si 0,337 mmol/l -AFB1+srot).

Studii analitice pentru determinarea raspunsului in vivo la nivel local (parametri biochimici, histologici si imunologici) in organele imune.

Efectul AFB1 si furajului cu srot asupra statusului antioxidant in organele interne. Ingerarea furajului contaminat cu AFB1 a condus la o scadere a statusului antioxidat in duoden, situsul absorbtiei nutrientilor, dar si al altor substante xenobiotice cum sunt contaminantii. Capacitatea antioxidanta totala (TCA) si activitatea enzimelor CAT, (GPx) si SOD au scazut TCA (-48.4%), CAT (-32.7%), GPx (-13.65%) si respectiv SOD (-9.50%) comparativ cu controlul. Includerea srotului in procent de 8% in furajul contaminat a ameliorat statusul antioxidant catre valorile inregistrate de purceii control, ceea sugereaza ca subprodusul vinicol utilizat are capacitatea de a contracara stresul oxidativ produs de micotoxina. In colon de asemenea, AFB1 a redus activitatea enzimatica si capacitatea antioxidanta totala, iar furajul cu srot 8% a avut un efect reparator catre valorile inregistrate de control. In ficat, splina si rinichi, organe interne cu rol cheie in procese imune si fiziologice importante AFB1 a produs efecte negative prin scaderea capacitatii antioxidante totale si activitatii enzimelor antioxidante. Aceste efecte au fost contracarate de includere srotului de seminte de struguri in furaj.

Efectul AFB1 si furajului cu srot asupra statusului inflamator. Raspunsul inflamator local a fost evaluat in organele interne (duoden, colon, ficat, splina si rinichi) prin determinarea unor markeri cheie ai inflamatiei, citokinele pro-inflamatoare: factorul de necroza tumorala alfa (TNF-α), interleukinele 1 beta (IL1-β) IL-6, IL-8, interferon gama (IFN-γ). Rezultatele au aratat un efect bifazic al toxinei, o scadere la nivelul duodenului si in contrast o crestere la nivelul colonului, ficatului si splinei. Astfel, AFB1 a redus in duoden concentratia de citokine pro-inflamatoare : IFN-γ (-15.30%), IL-1β (-42.90%), TNF-α (-34.21%) and IL-6 (-60.80%, Tabel 15) comparativ cu controlul, in timp ce in colon, ficat si splina furajul contaminat cu micotoxina a indus o crestere a concentratiei de citokine peste nivelul controlului. Includerea de 8% srot de seminte de struguri in furaj a fost eficienta in contracararea efectelor negative induse de micotoxina readucand concentratia acestor markeri catre nivleul inregistrat de control. De remarcat ca furajul cu srot, dar necontaminat cu toxina a avut el insusi un efect anti-inflamator prin reducerea concentratiei in duoden, colon si splina a unor citokine pro-inflamatoare confirmand proprietatile antioxidante anti-inflamatoare ale compusilor bioactivi sdin srotul de seminte.

Analiza histologica realizata la nivelul ficatului cu o coloratie uzuala H&E si o coloratie tricromica pentru punerea in evidenta a colagenului a aratat ca toxina a indus o steatoza hepatocitara marcanta, in special spre periferia lobulilor hepatici, dilatarea capilarelor sinusoide, inflamatie prin prezenta de infiltrate limfocitare in parenchimul hepatic si o usoara fibrozare. Administrarea furajului cu srot a atenuat aceste modificari histologice. Un aspect similar ficatului control a fost pus in evidenta de analiza histologicala a ficatului provenit de la purceii care au primit furaj cu srot fara toxina.

Testele de nutritie efectuate in biobaza experimentala a IBNA a permis recoltarea de probe de continut intestinal din colon si analiza efectului aflatoxinei B1 asupra comunitatii bacteriene din colon si totodata analiza capacitatii srotului de seminte de samburi de a modula schimbarile produse de micotoxina. Rezultatele obtinute au aratat ca dinamica micorbiomului intestinal a fost influentata atat de srotul de seminte de struguri cat si de aflatoxina. Firmicutes, Bacteroidetes, Proteobacteria, Actinobacteria, si Spirochaetes au fost principalele increngaturi bacteriene identificate in colon indiferent de tratament, Firmicutes fiind cea mai numeroasa, (58.33% la purceii care au primit NC cu srot si AFB1), urmata de Bacteroidetes (34.51%, la purceii care au primit NC control). Cele mai abundante genuri au fost Prevotella, Lactobacillus, Lachnospira and Campylobacter. Administrarea furajului cu 8% srot de seminte de struguri si a celui contaminat cu AFB1 au crescut semnificativ bacteriile apartinand increngaturii Bacteroidetes, si au scazut seminificativ Firmicutes. Furajul cu srot a scazut de asemenea genurile Lactobacillus, Lachnospiraceae, Bacteroidales si Campylobacter si a crescut Megasphaera, Prevotella si Clostridiales acestea din urma cu un efect benefic demonstrat auspra gazdei prin implicarea lor in metabolismul carbohidratilor si sinteza de acizi grasi cu catena scurta (acizi grasi volatili). Furajul contaminat incluzand srot si contaminat cu AFB1 au avut un efect sinergistic sau aditiv. La nivel de gen furajul cu srot a stimulat abundneta de Prevotella, actionand sinergistic cu AFB1, cea mai mare abundenta (48.1%) fiind observata in colonul purceilor hraniti cu furaj cu srot si AFB1 (SS+AFB1) comparativ cu controlul. In contrast, genul Lactobacilus a scazut in cazul tratamentelor cu srot si AFB1 si sinergistic cand au actionat impreuna (de la 50.5% in grupul control la 3,8% in SS+AFB),

 

Concluzii

Rezultatele obtinute in proiectul PED/189 au aratat ca aflatoxina B1 a produs efecte negative in perioada postintarcare alterand performantele purceilor (-25.1%), statusul antioxidant si raspunsul inflamator la nivel sistemic si local. Astfel, micotoxina a produs un efect bifazic asupra raspunsului inflamator prin scaderea markerilor pro-inflamatori la nivelul duodenului, situsul absorbtiei nutrientilor din hrana si bariera impotriva toxinelor si patogenilor si cresterea acestor markeri in ficat si in colon, organe cheie in metabolismul substantelor xenobiotice, metabolismul microbian si imun. Produsul furajer incluzand srot de seminte de struguri in proportie de 8% a diminuat efectele negative produse de aflatoxina, a ameliorat performantele de crestere si statusul antioxidant (capacitatea totala antioxidanta si activitatea enzimelor antioxidante catalaza, glutationperoxidaza si superoxid dusmutaza). Efectul dual asupra raspunsului pro-inflamator a fost modulat spre cel al controlului prin scaderea concentratiei de cytokine pro-inflamatoare in ficat si colon si cresterea lor in duoden.

Aceste rezultate sugereaza ca srotul de seminte de struguri si furajul incluzand acest subprodus vinicol este o sursa alternativa eficace in contracararea efectelor negative produse de hrana contaminata cu aflatoxina si poate fi folosit la purcei in perioada de intarcare.

 

Rezultatele noi obtinute in acest proiect contribuie la: i) dezvoltarea de solutii naturale (produs furajer cu proprietati decontaminante), ii) reciclarea reziduurilor vinicole rezultate din procesarea industriala a vinului, iii) cunoasterea mecanismelor moleculare produse de compusii bioactivi din reziduuri,

 

Nivelul final de maturitate tehnologica a proiectului

In cadrul proiectului PED 189 a fost obtinut un produs furajer (nutret combinat incluzand srot de seminte de struguri imbogatit in compusi bioactivi cu efect decontaminant si imunostimulator destinat purceilor dupa intarcare) care a fost testat in conditii de ferma experimentala ceea ce a insemnat un nivel 4 de maturitate tehnologica (TLR4 : Validarea componentelor și/sau a ansamblului în condiții de laborator). Acest produs urmeaza sa fie testat mai departe in sistem industrial (TLR5).

Indicatori de rezultate pentru etapa 2:

Publicatii

Articole ISI

1. Ionelia Taranu*, Daniela Eliza Marin, Mihai Palade, Gina Cecilia Pistol, Veronica Sanda Chedea, Mihail Alexandru Gras, Catalin Rotar. 2018. Assessment of the efficacy of a grape seed waste in counteracting the changes induced by aflatoxin B1 contaminated diet in performance, plasma, liver and intestinal tissues of pigs after weaning. Toxicon-D-18-00512.(Impact factor=2.58)
2. Iulian Grosu, Gina Pistol, Ionelia Taranu, Daniela Marin. 2018. The impact of dietary grape seed meal on healthy and aflatoxin afflicted microbiota of pigs after weaning. Toxins- 403729 (Impact factor=3,27).
3. Daniela Marin, Gina Pistol, Cristina Bulgaru, and Ionelia Taranu. 2018. Effects of individual and combined exposure of HepG2 cells to zearalenone and its metabolites Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. (Impact factor=2.23) (acceptat):

 

Manifestari stiintifice:

Titlu comunicare	Manifestare stiintifica	Autori
Beneficial effect of dietary bioactive compounds from grape seed meal, a by-product of wine processing on oxidative damage induced by AFB1 in liver of pig	40th Mycotoxin Workshop, Munich, Germany, June 11 - 13, 2018	Ionelia TARANU, Gina Cecilia PISTOL, Iulian Alexandru GROSU, and Daniela Eliza MARIN
Dietary grape seed waste reduce the toxic effect induced by aflatoxin in tissues of weaned piglets	7th International Symposium “Prospects for the 3rd Millennium Agriculture”, Cluj, Romania, 27 - 29 September 2018	Ionelia TARANU, Daniela MARIN, Gina PISTOL, Veronica Sanda CHEDEA, Mihai Al. GRAS, Catalin ROTAR
The Impact Of Dietary Grape Seed Meal On Healthy And Aflatoxin Afflicted Weaned Pigs Microbiota	the 12th world congress on Polyphenols Applications, Bonn, Germany, 25 -28 September, 2018	Grosu Iulian Alexandru, Palade Mihai Laurentiu, Pistol Gina Cecilia, Marin Daniela Eliza, Taranu Ionelia