ADER 8.1.10/2019

Titlul proiectului: Caracterizarea genomică a raselor locale de ovine în vederea creării unor populații de referință ce vor fi folosite la estimarea valorii de ameliorare genomică

Tipul proiectului: Cercetare

Cod proiect: ADER 8-1-10
Nr. Contract/data: 8.1.10/24-09-2019
Unitatea Finantatoare: Ministerul Agriculturii și Dezvoltării Rurule

Coordonator proiect: INCDBNA-IBNA Balotești

Partener(i): S.C. Ovis Cap Negru S.R.L

 

Rezumat:

Metodele tradiționale de ameliorare a ovinelor au dus la specializarea acestora și scăderea variabilității caracterelor de importanță economică. Populațiile locale de ovine, pe de altă parte, au menținut prin prezervarea „in situ” o variabilitate mărită ce poate oferi adaptabilitate mai bună a animalelor la noile condiții de mediu și implicit a unei producții sustenabile. La ora actuală, evaluarea genetică a reproducătorilor din populația de ovine, pe baza performanțelor proprii și a indivizilor înrudiți, este foarte costisitoare atât din punct de vedere financiar cât și al timpului.  Evaluarea genomică permite identificarea indivizilor valoroși din punct de vedere genetic încă de la nașterea acestora, scurtând foarte mult procesul de selecție și costurile legate de acesta. Din acest punct de vedere, selecția genomică va intensifica ameliorarea atât a producției de lapte și carne la ovine, cât și rezistența la îmbolnăvire a acestora. La nivel internațional, țări precum Franța, Anglia, Australia, folosesc selecția genomică la rasele specializate dar și ca instrument de prezervare la rasele locale. Până în prezent, în România nu s-a folosit informația genomică în cadrul programelor de amelioare a ovinelor. Este strict necesară implementarea unei strategii naționale de ameliorare genomică a caracterelor cu importanță economică la specia ovine, în vederea alinierii domeniului creșterii ovinelor la standardele europene și implicit cele internaționale. Selecția genomică reprezintă utilizarea informației oferită de polimorfismul unei singure nucleotide, la estimarea valorii de ameliorare, fără a fi neapărat cunoscută locația genelor care afectează caracterele ce fac obiectul ameliorării. Primul pas în selecția genomică este stabilirea unui grup de referință ce caracterizează cel mai bine din punct de vedere morfo-productiv rasa de ovine. Următorul pas este reprezentat de genotiparea indivizilor din grupul de referință cu ajutorul tehnologiilor moderne, SNP chip. După genotipare se va estima, cu ajutorul metodologiei GWAS, studiul de asociere al genomului cu fenotipurile, efectul SNP asupra caracterelor de interes economic. După estimarea efectului SNP în grupul de referință se poate calcula valoarea de ameliorare genomică a oricărui animal ce va fi genotipat în populația de bază.

 

Obiective:

Având în vedere politicile și strategiile Ministerului Agriculturii și Dezvoltării Rurale din România (ADER) și ale Uniunii Europene (H2020), probleme propuse spre rezolvare în cadrul acestui proiect sunt în concordanță cu politicile anterior menționate. Pentru ca România să aibă o șansă reală de participare la o economie globală, trebuie să se bazeze pe probleme rezolvate în cadrul acestui proiect care vor conduce la transferul de cunoștințe și inovare în zoothenia Românească. Ca în cazul oricărui proiect trebuie discutat de partea fundamentală care în acest caz își propune să găsească asocierea SNP-urilor cu producțiile ridicate ale ovinelor, iar partea aplicativă care va conduce la înglobarea acestei informații genomice împreună cu informațiile fenotipice care vor conduce la estimate ale valorilor de ameliorare foarte apropiate de valoarea genetică reală. Toate acest aspecte favorabile vor conduce la o buna dezvoltate a asociațiilor de crescători și implicit a fermierilor. Utilizând infomația genomică și aplicând cele mai noi tehnologii de bioinginerie și biostatistică proiectul poate schimba radical performanțele zootehniei din România. În același timp, rasele de ovine vor evolua rapid și în direcția dorita, fapt ce va conduce la o mai bună legătură între cercetare și fermieri.

Obiective măsurabile

Scopul proiectului de față este acela de a pune bazele unei populații de referință prin genotiparea ovinelor din rasele locale, populație cu ajutorul căreia să se poate estima valoarea de ameliorare genomică. Astfel, pentru a atinge ceea s-a propus este nevoie de câteva etape măsurabile: cu ajutorul controlului oficial al performanțelor să se pună bazele unei baze de date care să cuprindă informații fenotipice (cantitatea de lapte, greutăți corporale, evaluarea exteriorului, informații despre reproducție); estimarea efectului SNP-urilor asupra caracterelor evaluate prin cele mai noi metode biometrice; estimarea componenților de varianță-covarianță care implicit conduc la estimarea parametrilor genetici; identificarea celor mai bune metodologii de analiză biometrică care vor fi folosite la predicția valorii de ameliorare. Ca obiective secundare ale proiectului amintim: optimizarea metodelor de măsurare a fenotipurilor; optimizarea metodelor alese pentru estimarea parametrilor genetici în funcție de specificul caracterelor (caractere cu heritabilitate mică, caractere care se măsoară repetat în decursul vieții productive ale animalului); verificarea SNP-urilor corespunzătoare populațiilor analizate și identificarea densității panelurilor ce urmează a fi folosite la genotipare; analiza comparativă a diverselor metode matematice folosite în estimarea valorii de ameliorare genomice.

 

Derularea activitatilor:

An

Obiective

Activitati

2019

Studiu bibliografic privind estimarea efectului SNP-urilor implicate în manifestarea caracterelor din obiectivul ameliorării ovinelor.

Activitate 1.1:Studii privind identificarea SNP-urilor și estimarea efectului acestora

Activitate 1.2: Studii privind evaluarea SNP-urilor cu ajutorul metodei GWAS

Activitate 1.3: Studii privind modul de foloșire și integrare a selecției genomice în estimarea valorii de ameliorare la ovine

2020

Estimarea efectelor SNP-urilor asupra caracterelor din grupul producției de lapte

Activitate 2.1: Colectarea datelor fenotipice

Activitate 2.2: Colectarea probelor biologice

Activitate 2.3: Prelucrarea datelor colectate

Activitate 2.4: Estimarea parametrilor genetici pentru caracterele producției de lapte

Activitate 2.5 Utilizarea metodei GWAS pentru estimarea efectului SNP-urilor

Activitate 2.6 Analiza polimorfismelor SNP-urilor asociate cu caracterele producției de lapte

Activitate 2.7: Estimarea valorii de ameliorare genomice

2021

Estimarea efectelor SNP-urilor asupra caracterelor din grupul producției de carne

Activitate 3.1: Colectarea datelor fenotipice

Activitate 3.2: Colectarea probelor biologice

Activitate 3.3: Prelucrarea datelor colectate

Activitate 3.4: Estimarea parametrilor genetici pentru caracterele producției de carne

Activitate 3.5:Utilizarea metodei GWAS pentru estimarea efectului SNP-urilor

Activitate 3.6: Analiza polimorfismelor SNP-urilor asociate cu caracterele producției de carne

Activitate 3.7: Estimarea valorii de ameliorare genomice

2022

Estimarea efectelor SNP-urilor asupra caracterelor din grupul reproducție

Activitate 4.1: Colectarea datelor fenotipice

Activitate 4.2: Colectarea probelor biologice

Activitate 4.3: Prelucrarea datelor colectate

Activitate 4.4: Estimarea parametrilor genetici pentru caracterele de reproducție

Activitate 4.5: Utilizarea metodei GWAS pentru estimarea efectului SNP-urilor

Activitate 4.6: Analiza polimorfismelor SNP-urilor asociate cu caracterele de rerproducție

Activitate 4.7: Estimarea valorii de ameliorare genomice

 

Rezultate asteptate:

- Crearea și dezvoltarea unei baze de date cu valori fenotipice ale caracterelor de producție, reproducție și de bunăstare precum și genotipurile la populația de referință;

- Metodologie nouă de estimare mai precisă a parametrilor genetici ai populațiilor locale de ovine din România;

- Studiu de implementare a noii metode non-invazive de evaluare mai rapidă a cantității de carne în carcasă, prin metoda ecografică;

-Estimarea efectului polimorfis-melor mononucleotidice asupra caracterelor cu importanță economică și elaborarea ecuațiilor de predicție ce vor sta la baza implementării informației genomice, în programele de ameliorare;

- Studiu de identificare și selectare a unor markeri moleculari Single Nucleotide Polymorphism - SNP, cu impact major în producția și sănătatea animalelor, în vederea utilizării lor în calcularea valorii de ameliorare genomice;

-Elaborarea unui model matematic ce va putea fi utilizat în viitor la estimarea valorii de ameliorare genomică la ovine.

 

Stadiul proiectului si rezultate obtinute:

Etapa 1. Studiu bibliografic privind estimarea efectului SNP-urilor implicate în manifestarea caracterelor din obiectivul ameliorării ovinelor.

Obiectivele Etapei:

- Studii bibliografice privind identificarea SNP-urilor și estimarea efectului acestora;

- Studii privind evaluarea SNP-urilor cu ajutorul metode GWAS;

-Studii privind modul de foloșire și integrare a selecției genomice în estimarea valorii de ameliorare la ovine

Raport de fază al proiectului

 

Rezumatul Etapei 1

Dezvoltarea recentă a studiilor privind polimorfismul unei singure nucleotide (SNP) la nivelul întregului genom a facut posibil să se efectueze mai multe cercetări la diferite specii. Selecția poate crește sau reduce frecvența alelelor (genelor) la diferiți loci în genom. Identificarea genelor implicate în controlul și expresia caracterelor economice este foarte importantă. SNP-urile sunt de obicei dialelice. SNP-urile sunt în prezent markerii preferați pentru majoritatea studiilor genomice.Există multe platforme comerciale disponibile care au fost optimizate pentru eficiență ridicată și viteză de generare a datelor, de exemplu cipul de 600 K SNP pentru ovine (Ovine Infinium HD SNP BeadChip, Ilumina, Inc., San Diego, CA, SUA). Efectul fiecărui SNP asupra principalelor însușiri se estimează pentru un număr suficient de mare de caractere, după care urmează detectarea asocierilor dintre markerul SNP și genele care controlează caracterul de interes (analiza GWAS). Se testează din punct de vedere statistic semnificația efectului fiecărui marker, reținându-se pentru realizarea selecției genomice doar acei markeri SNP care au un efect semnificativ asupra nivelului caracterelor analizate. Meuwissen și col., 2001, pe baza informațiilor deținute de markerii moleculari, au propus metoda selecției genomice în care valoarea de ameliorare poate fi predictată pe baza informațiilor markerilor răspândiți în întreg genomul. Sunt estimate efectele genetice ale fiecărui marker, după care acestea sunt însumate pentru a prezice valoarea de ameliorare totală a animalului. Procedura care furnizează valori de ameliorare predictate pe baza informațiilor moleculare se va numi evaluare genomică, în timp ce selecția genomică se referă la deciziile de selecție bazate pe aceste valori de ameliorare genomică. Ideea de bază în considerarea selecției genomice este aceeea că fiecare genă care coordonează manifestarea fenotipică a unui caracter cantitativ se află în dezechilibru de linkage cu cel puțin un marker SNP. Dacă densitatea markerilor este suficient de mare întreaga variabilitate genetică poate fi explicată de către aceștia, ceea ce conferă selecției genomice o mai mare precizie în predicția valorilor de ameliorare comparativ cu selecția asistată de markerii genetici. Asocierile de tip linkage între markerii genetici SNP și genele care controlează caracterele cantitative furnizează informații genomice care pot fi utilizate la selecția caracterelor de interes economic

 

FAZA II/2020

Estimarea efectelor SNP-urilor asupra caracterelor din grupul producției de lapte

Activitatea 2.1: Colectarea datelor fenotipice

Activitatea 2.1: a fost realizată de către CP –INCDBNA Balotești în colaborare cu partenerul P1- S.C. OVIS CAP NEGRU

Pentru buna desfasurare a fazei 2/2020 a proiectului ADER 8.1.10. au fost colectate date fenotipice de la ferma S.C. OVIS CAP NEGRU S.R.L. (partenerul 1 in proiect) din localitatea Dobrotesti, Teleorman.

In total au fost adunate informatii de la 450 de ovine din rasa Cap Negru de Teleorman, iar pentru fiecare oaia in parte au fost inregistrate urmatoarele:

  • 6 cantitati de lapte efectuate etapizat, cate doua controale pe o perioada de 24 de ore timp de 3 luni consecutive. La fiecare control s-a cantarit cantitatea de lapte produsa de o oaia la mulsul de seara si la mulsul de dimineata.
  • Informatii privind registrul genealogic. Mai exact, pentru fiecare animal au fost centralizate informatii cu privire la parintii din care provin oile si eventuali descendenti, acolo unde a fost cazul.

Activitatea 2.2: Colectarea probelor biologice

Activitatea 2.2: a fost realizată de către CP –INCDBNA Balotești în colaborare cu partenerul P1- S.C. OVIS CAP NEGRU

Intrucat obiectivul principal al proiectului este formarea unei populatii de referinta in vederea estimarii valorii de ameliorare genomice la rasele de ovine este nevoie sa se cunoasca genotipurile animalelor care urmeaza sa formeze aceasta populatie.

Genotiparea se poate face din diferite probe de tesut recoltate de la animalele care fac obiectul analizei. Probele te tesut pot fi:

  • Tesut auricular;
  • Foliculi pilosi;
  • Sange;
  • Materiala seminal doar in cazul masculilor.

In cadrul proiectului s-a ales ca proba biologica sangele. Astfel, au fost recoltate probe de sange din vena aorta de la un numar de 196 animale. Toate probele recoltate au fost de la animale din rasa Cap Negru de Teleorman de la ferma S.C. OVIS CAP NEGRU S.R.L.

Activitatea 2.3: Prelucrarea datelor colectate

In urma colectarii datelor din teren, au rezultat o serie de fisiere excel in care au fost acumulate datele privind productia de lapte, procentul de grasime, cantitatea de grasime, procentul de proteina, cantitatea de proteina si densitatea laptelui de oaie.

Pentru a putea continua analizele din activitatile urmatoare, a fost necesara o prelucrare statistica primara a datelor brute ce urmau a fi introduse ulterior in analizele cu o complexitate matematica ridicata pentru obtinerea valorilor de ameliorare genomice si a parametrilor genetici.

Astfel, au fost calculati o serie de statisci care sa ofere informatii cat mai complete si complexe despre efectivul de ovine luat in studiu.

Fiecare control al performantei efectuat a fost analizat individual. Conforma tabelelor 1,2 si 3 se poate observa descrierea statistica a datelor rezultate in urma celor trei controale oficiale ale performantelor, iar in tabelul 4 sunt cumulate informatiile de la cele 3 controale.

 

Activitatea 2.4: Estimarea parametrilor genetici pentru caracterele producției de lapte

Pe baza inregistrarilor fenotipice colectate cu ajutorul programului informatic R au fost calculate pe baza metodologiei B.L.U.P (Best linear unbiased prediction – Cea mai buna predictie liniara nedeplasata) aplicata modelului Test-Day Fixed Regression (Modelul zilei de control cu regresii fixe).

Modelul biometri a fost:

  image_2021-07-29_081947.png

Unde:

ytijk =  cantitatea de lapte pentru animalul analizat;

HTDi = efectul fix pentru factorul ferma-ziua-de-control;

βm = coeficientii de regresie Legendre;

αjm = coeficientii de regresie Legendre pentru efectul genetic;

γjm   = coeficientii de regresie Legendre pentru efectul de mediu permanent;

etijk   = reziduala modelului.

Tabelul 1 – Heritabilitatile si repetabilitatile pentru cantitatea de lapte

 

COP 1   

COP 2   

COP 3   

Heritabilitate

0.105

0.27

0.25

Repetabilitatea      

0.123

0.324

0.306

 

Activitatea 2.5: Utilizarea metodei GWAS pentru estimarea efectului SNP-urilor

Informația Genomică

Odată cu avansarea cercetării o nouă informație a devenit disponibilă și care poate fi inclusă în evaluarea genetică pentru creșterea acurateții valorilor de ameliorare.  Genomica valorifică prezența polimorfismelor unor singure nucleotide (SNP – Single Nucleotidic Polymorphism) și asocierea acestora cu producții cantitative și calitate superioare. De asemenea, cu ajutorul informației genomice se poate știi cu exactitate ascendența și descendența unui animal. Acest lucru poate fi folosit acolo unde există suspiciuni că în cazul unor înregistrări genealogice s-au strecurat erori. Întrucât cerința pentru genotipare este tot mai mare atât pentru masculi cât și pentru femele, costurile s-au redus foarte mult în ultima vreme, astfel informația genomică o să fie tot mai accesibilă și pentru țările în care sectorul zootehnic nu este foarte puternic din punct de vedere financiar. Având în vedere faptul că identificarea SNPs-urilor se face pe baza ADN-ului animalului conduce la scăderea intervalului între generații întrucât nu mai este nevoie să se aștepte ca animalul să aibă producții inregistrate. Trebuie avut în vedere insă faptul că pentru a putea estima valorile de ameliorare pentru animalele foarte tinere, avem nevoie de o populație de referință.  Formarea unei astfel de populații se face doar când controlul oficial, înregistrarea genealogiei și genotiparea se face pentru un efectiv reprezentativ de ovine dintr-o rasă. Abia în momentul în care avem o populație de referință care este în controlul oficial al performanțelor și au fost și genotipate, se poate face estimarea valorilor de ameliorare pentru animalele abia născute. Selecția genomică ajută la creșterea eficienței economice a unei ferme datorită unei serii de avantaje. Primul este acela că la reproducție de la o generația la alta or să fie selecționate cele mai bune animale din punct de vedere genetic. Scăderea costurilor cu reproducătorii masculi în sensul că imediat după naștere, cu ajutorul valorii de ameliorare genomice, decizia de selecție se face imediat, astfel nu trebuie să fie opriți decât acei masculi care probează în ceea ce privește valoarea de ameliorare, iar ceilalți masculi pot merge direct către îngrășare și respectiv abatorizare.

Au fost genotipate un număr de 67000 SNP-uri. Cele mai bune practici de calitate au dus la eliminarea a 17000 SNP-uri și reținerea în analiză a 50000 SNP-uri.

 

Activitatea 2.6: Analiza polimorfismelor SNP-urilor asociate cu caracterele producției de lapte

Efectul fiecărui SNP asupra principalelor însușiri se estimează pentru un număr suficient de mare de caractere, după care urmează detectarea asocierilor dintre markerul SNP și genele care controlează caracterul de interes (analiza GWAS). Se testează din punct de vedere statistic semnificația efectului fiecărui marker, reținându-se pentru realizarea selecției genomice doar acei markeri SNP care au un efect semnificativ asupra nivelului caracterelor analizate Studiul de asociere la nivel de genom, cunoscut și sub numele GWAS, reprezintă un studiu al unui set de variante genetice la nivelul genomului la diferiți indivizi cu scopul de a analiza dacă orice variantă genetică este asociată cu o trăsătură investigată. GWAS se concentrează pe asocierile dintre polimorfismele cu un singur nucleotid (SNP) și diferite caractere.

 

Activitatea 2.7: Estimarea valorii de ameliorare genomice

Pentru estimarea valorii de ameliorare genomice a fost folosita metodologia BLUP aplicata modelului Animal la care a fost adaugata informatia Genomica rezultata in urma genotiparii ovinelor.

Modelul biometric pentru estimarea valorilor de ameliorare genomice

 yi = Bi + aj  + eij

unde:

yij - cantitatea de lapte;

Bi – efectul fix;

aj – efectul aleator pentru efectul genetic;

eij – reziduala modelului.

Modelul biometric in notatie matriciala pentru estimarea valorilor de ameliorare

 image_2021-07-29_081838.png

X, Z sunt matricile de incidenta pentru efectul fix, efectul genetic;

A = matricea de inrudire;

G = matricea de variante si covariante genetice;

Efectivul de ovine analizat in faza 2/2020 a proiectului ADER 8.1.10 a fost analizat, iar in final au fost estimate valorile de ameliorare genomice. Scopul final a fost acela de a putea avea pentru fiecare animal valoarea de ameliorare genomica. Pe baza acestor rezultatea de la evaluarea genetica animalele pot fi selectionate, astfel, fiind promovate la reproductie acele animale cu o valoarea genetica ridicata care sa asigure obtinerea de productii de lapte cantitative si calitative superioare.

PREVIOUS

ADER 8.1.6/2019

NEXT

ADER 9.1.4/2019