PN-III-P2-2.1-PED-2019-2436

Titlu proiect : Formula nutritionala imbogatita in nutrienti bioactivi cu efect antimicrobian pentru inlocuirea oxidului de zinc la purcei dupa intarcare

Acronim: Zincored

Support financiar: UEFISCDI

COD Proiect: PN-III-P2-2.1-PED-2019-2436

Contract nr. 396

 

REZUMAT

     Importanța oxidului de zinc în controlul diareei după înțărcare a crescut după interzicerea antibioticelor (2006). La nivelul UE, s-a propus retragerea până în 2023 a utilizării oxidului de zinc ca premix de interventie, din cauza impactului negativ pe care zincul îl poate avea asupra mediului. Unele țări europene au interzis deja utilizarea terapeutică a oxidului de zinc la porc, în timp ce în altele, folosirea acestuia nu este încă interzisă. În acest context, obiectivul prezentului proiect este de a dezvolta o noua formulă de nutret combinat cu potential antimicrobian, bazată pe utilizarea srotului de rapita fermentat, care ar putea înlocui oxidul de zinc prin reducerea inflamației intestinale tranzitorii, diareei și a stresului oxidativ la purcei in perioada de înțărcare.

     Proiectul include trei etape și 14 activități experimental demonstrative. Faza 1 se concentreaza pe fermentarea srotului de rapiță cu Saccharomices sp. și caracterizarea lui. Faza 2 include studii in vitro pe culturii de celule, în care potențialul srotului de rapiță fermentată ca înlocuitor al ZnO va fi investigat în enterocitele intestinale și celulele goblet de porc. Faza a-3 se focuseaza pe studii in vivo. Experimentele vor fi realizate pe purcei dupa intarcare in care se vor investiga capacitatea noului produsului furajer incluzand srotul de rapita fermentat de a înlocui ZnO.
Dezvoltarea noii formule nutriționale va include trei niveluri de TRL (TRL 2,3 și 4) și va include activități de cercetare aplicată A2 (A2.1, A2.2, A2.3).

     Proiectul include trei etape și 14 activități demonstrative. Faza 1 se va concentra pe fermentarea srotului de rapiță cu Saccharomices sp și caracterizarea lui. Faza 2 se va concentra pe studii in vitro pe culturii de celule, în care potențialul srotului de rapiță fermentată ca înlocuitor al ZnO va fi investigat în enterocitele intestinale și celulele goblet. Faza a -3 a va fi focusata pe studii in vivo. Experimentele vor fi realizate pe purcei dupa intarcare in care se vor investiga capacitatea noului produsului furajer incluzand srotul de rapita fermentat de a înlocui ZnO.

     Rezultatele preconizate: i) dezvoltarea unei noi formule nutritive eficiente în reducerea inflamației intestinale tranzitorii, a diareei și a stresului oxidativ la purcei după înțărcare; (ii) reciclarea subproduselor din industriile agroalimentare; exploatarea srotului de rapiță fermentat ca un nou agent de înlocuire a ZnO (iii) O mai bună înțelegere a rolului și a mecanismelor compușilor bioactivi care pot avea un efect benefic asupra sănătății purceilor după înțărcare.

 

ECHIPA DE CERCETARE

1. Ionelia Taranu, coordonator  proiect
2. Daniela Marin, membru in echipa
3. Gina Cecilia Pistol, membru in echipa
4. Mihai Palade, membru in echipa
5. Iulian Grosu, membru in echipa
6. Mihai Gras, membru in echipa
7. Catalin Rotar, membru echipa

 

ETAPA 1

     Etapa 1 s-a concentrat pe fermentarea șrotului de rapiță. Pentru testele de fermentare a șrotului s-a fost folosit metoda descrisă de Plaipetch and Yakupitiyage (2012) care a constat  în : 1) pregătirea mediului pentru inocul și a mediului pentru fermentație;  2) inocluarea mediului cu Saccharomyces boulardi in concentrație de 1x10⁷ col/mL (Fig. 1). 3) inocularea mediului de fermentație: 2 mL de  inocul a fost mixat cu 40 g de șrot de rapiță și 60 mL apă pentru obținerea unei umidități de 60%.

     Au fost testate mai mule intervale de timp de fermentație (24-120 ore). Rezultatele au arătat o creștere exponențială a numărului de colonii. Cel mai mare număr de colonii (7,4 x10⁸) a fost obținut după 120h de fermentație a șrotului de rapiță.

     Compoziția chimică brută (substanță uscată, proteină brută, grăsime brută, celuloză brută și cenușă) și conținutul de compuși bioactivi (macro- și micro-minerale, polifenoli) ai șrotului de rapiță fermentat au fost estimate în laboratorul pentru calitatea furajelor și produselor animale al IBNA utilizând metoda Weende și absorbția atomică în conformitate cu Asociația de Standardizare din România (Regulamentul CE, nr.152 / 2009 ASRO, SR ISO / 2001-2010, http://www.asro.ro), Regulamentul CE nr.152/2009 STAS 9597/16-86STAS 9597/17-86 și metoda Folin-Ciocâlteu. Pentru analiză a fost ales timpul de fermentare de 120h prin care s-a obținut cel mai mare număr de colonii de S. boulardi.

     Procesul fermentativ a crescut proteina brută a șrotului cu +8,65% față de proteina obținută pentru șrotul de rapiță nefermentat. Nu au fost diferențe pentru grăsime, celuloză și cenușă brută. Analiza compușilor bioactivi a arătat că fermentarea nu a modificat semnificativ concentrația de macro-minerale din șrotul de rapiță in comparație cu șrotul nefermentat, dar a pus în evidență o creștere a conținutului de Fe, Mn și Zn (microelemente cu rol benefic în buna funcționare a sistemului imun și a mecanismelor de apărare anti-infecțioasă), în comparație cu șrotul nefermentat. Comparativ cu șrotul nefermentat nivelul de polifenoli totali măsurat la toți timpii de fermentare testați a crescut comparativ cu șrotul nefermentat (0,65 mgGAE/ml), ceea ce sugerează că fermentarea cu drojdii care sunt o sursă bogată în polifenoli a contribuit la creșterea conținutului de polifenoli în șrot.

 

ETAPA 2

     Etapa 2-a a proiectului PED 396 s-a concentrat pe studii in vitro pe culturi celulare în care au fost studiate capacitatea șrotului de rapiță fermentat de a înlocui ZnO și de a diminua efectul Escherichiei coli luată ca model patogenic. Studiile celulare au fost realizate într-un sistem celular complex prin cultivarea simultană (co-cultură) a două tipuri de celule intestinale, enterocite și celule producătoare de mucine. Obiectivele fazei:

• Evaluarea efectelor și mecanismelor celulare și moleculare de acțiune subiacente produse de ZnO și extractul de șrot de rapiță;
• Obținerea unor rezultate cu caracter de predicție pentru a oferi o orientare pentru studiile experimentale in vivo.

     Șrotul de rapiță testat in vitro a fost fermentat atât cu Saccharomyces boulardi cât și cu Saccharomyces cerevisiae utilizând ca și în etapa 1 metoda descrisă de Plaipetch and Yakupitiyage (2012).

     Rezultatele privind compoziția chimică a șrotului fermentat  au arătat că fermentarea indiferent de tulpina de drojdie utilizată a condus la modificări ale compoziției chimice a șrotului de rapiță. Cea mai importantă modificare produsă a fost scăderea semnificativă a concentrației de factori anti-nutriționali evaluată prin nivelul de glucozinolați care au scăzut la jumătate față de șrotul nefermentat (-50,0% pentru SRF-Sc și respectiv 53,97% pentru SRF-Sb). Fermentarea cu S. cerevisiae a crescut nivelul de proteină brută (+4,69%), fibre (+41,89%) și minerale (P, +11,02, Na, +11,10). %, Fe, +28,05%, Cu, +3,18%, Mn, +29,49% și Zn, +8,19%), cea mai mare concentrație fiind înregistrată pentru Fe (266,38 ppm vs 208,03 ppm) și Mn (226,42 ppm vs 174,86 ppm), două elemente importante în răspunsul imun. Fermentarea șrotului de rapiță cu S. boulardi a condus la o creștere mai mare a nivelului de proteină brută (+16,08%), fibre (+78,16%), cenușă (+27,70%) și unele minerale (Ca, 50%, P, +22,88, K, +28,95%, Mg, +118,97%, Fe, +34,14%) comparativ cu șrotul nefermentat sau fermentat cu S. cerevisiae. În contrast, concentrația de Cu, Mn și Zn a fost mai mică. Analiza chimică a pus în evidență o creștere a concentrației unor compuși bioactivi ca de exemplu, epicatechină și acid ferulic în cazul ambelor drojdii. Concentrația de acizi grasi polinesaturați, o altă clasă importantă de compuși bioactivi implicați în inflamație a arătat că doar fermentarea șrotului de rapiță cu Sacharomices boulardi a produs o creștere a concentrației totale a acestora.

     Primele rezultatele obținute în studiile in vitro au arătat că extractul de șrot de rapiță fermentat este capabil să inhibe creșterea Escherichiei coli. Într-un model celular complex incluzând celule epiteliale intestinale (IEC) și celule producătoare de mucine a fost analizată capacitatea extractelor de șrot de rapiță fermentat de a inhiba acțiunea endotoxinei bacteriene (LPS) care a fost evaluată prin măsurarea unor parametri specifici pentru inflamație și stres oxidativ. Testele de citotoxicitate au demonstrat o acțiune stimulatoare a extractelor de șrot de rapiță fermentat indiferent de tulpina de drojdie utilizată pentru fermentare. Răspunsul imun înnăscut a fost evaluat prin determinarea expresiei genelor care codifică sinteza proteică a receptorilor de tip toll (Toll-like recepors-TLRs), molecule cheie care recunosc agenții patogeni după ce aceștia trec de bariera fizică a epiteliului intestinal și apoi activează răspunsurile celulelor imune. Tratamentul cu ZnO (50 µM) a reușit să contracareze acțiunea E. coli-LPS. Cu excepția expresiei genice codante pentru TLR2, expresia genelor celorlalți receptori toll like a fost diminuată cu 34,8% în cazul TLR4, 56,4% pentru TLR5 și 47,5% pentru TLR9 (Figura 5) comparativ cu E. coli-LPS.

     Tratamentul cu șrot de rapiță fermentat cu S. cerevisiae a diminuat expresia genică a TLR4 supraexprimată de E.coli-LPS; o diminuare cu 55.7% a expresiei genice a TLR4, ligandul specific al LPS, responsabil de activarea căii de semnalizare a factorului nuclear kB (NF-kB) care declanșează inflamația.

     Șrotul de rapiță fermentat cu Saccharomices boulardi s-a dovedit mai eficace în a contracara efectul endotoxinei comparativ cu șrotul fermentat cu S. cerevisiae. Expresia genică a receptorilor Toll like supra-exprimată de LPS a fost semnificativ diminuată cu 32.6% pentru TLR2, 43,3% pentru TLR4, 69.6% pentru TLR5 și 67.3% în cazul TLR9.

     Răspunsul inflamator a fost evaluat prin determinarea la nivel genic și proteic a citokinelor pro-inflamatoare: interferon (IFN-γ), interleukina 1-beta (IL1-β), interleukina -8 (IL-8), factorul de necroză tumorală alfa (TNF-α). Ca și în cazul receptorilor Toll likes rezultatele au arătat că E.coli-LPS a activat puternic expresia genelor codante pentru toate citokinele pro-inflamatoare. Cea mai puternică activare a fost observată pentru TNF-α, urmată de IL-1β, cele mai importante citokine care induc inflamația. Adaosul de 50µM de ZnO în celulele tratate cu E. coli-LPS a supresat acțiunea endotoxinei, expresia genică a celor patru citokine analizate scăzând semnificativ cu -62,9% (IFN-γ), -58,7% (IL-1β), 85,1% (TNF-α) și -60,6% (IL-8) față de LPS. Similar, tratamentele cu extractele șrotului fermentat cu cele două drojdii au inhibat efectul pro-inflamator produs de E. coli-LPS.

     Cu excepția expresiei genice a interleukinei 8 pentru care inhibiția a fost mai mică (-0.88%), expresia genelor codante pentru IFN-γ, IL-1β și TNF-α a scăzut semnificativ cu 30%, 49,3% și respectiv 81,0% sub acțiunea extractului de rapiță fermentat cu S. cerevisiae comparativ cu LPS. S-a remarcat procentul mare de contracarare a genei codante pentru TNF-α de către extractul fermentat cu S. cerevisiae, ceea ce sugereză că subprodusele fermentate pot fi utilizate  ca alternative la ZnO.

     Extractul de șrot de rapiță fermentat cu S. boulardi a inhibat toate cele patru gene codante pentru citokinele pro-inflamaoare analizate. Supra-exprimarea indusă de E. coli-LPS a fost diminuată cu -42,1% (IFN-γ), -64,5% (IL-1β), -72,41% (TNF-α) și respectiv -40,5% (IL-8). Aceste rezultate confirmă acțiunea de probiotic a S. boulardi cunoscută pentru proprietățile ei anti-inflamatoare. Extractele de șrot de rapiță fermentat au reușit să inhibe de asemenea acțiunea endotoxinei dovedind potențial de a înlocui oxidul de zinc. O scădere cu 38.36% și cu 36.36% în comparație cu LPS a fost produsă de șrotul fermentat cu S. cerevisiae și respectiv S. boulardi a expresiei genei codante pentru NLRP6 una din proteinele importante ale inflamazomului esențial pentru auto-reînnoirea mucoasei, proliferarea și secreția de mucus.  Mecanismele de acțiune prin care ZnO și extractele de șrot de rapiță fermentat au reușit să inhibe acțiunea E. coli-LPS au fost evaluate prin analiza expresiei genice a proteinelor SMAD (SMAD 2, SMAD3 și SMAD7) cu rol cheie în calea de semnalizare a TGF-B (transforming growth factor beta) o superfamilie de proteine cu rol critic în reglarea creșterii și dezvoltării celulare precum și în reglarea proceselor inflamatoare în special în intestin. Extractele de șrot de rapiță fermentat cu ambele tulpini de drojdii au inhibat efectul endotoxinei asupra expresiei genice a proteinelor SMAD ceea ce confirmă potențialul anti-inflamator al șrotului fermentat atât la nivelul moleculelor efectoare anti-inflamatoare cât și la nivelul mecanismelor implicate în inflamație.

     Stresul oxidativ evaluat la nivel proteic și al acizilor nucleici a demonstrat că prezența ZnO și a extractelor de șrot de rapiță fermentată a contracarat concentrația de protein carbonil indusă de endotoxina E.coli-LPS

 

ETAPA 3

    Studiile in vitro au elucidat mecanismele moleculare induse ZnO si extractele de rapita fermentat, care au contracarat efectul produs de expunerea la E.coli-LPS asupra proteinelor de semnalizare asociate inflamației si migrarii celulare (15 proteine din 23 analizate), proliferării celulare/ciclului celular/diferențierii celulare și factorilor de transcripție (13 proteine din 23 analizate). Sinteza de radicali liberi (ROS), apotoza celulara, oxidarea lipidica si proteica si activitate metaloproteinazelor (MMP2 si MMP9) induse de E.coli-LPS au fost de asemenea contracarate de extractele de srot fermentat cu Saccharomyces cervisiae si Saccharomyces boulardi.

    Rezultatele obtinute in vivo aceasta etapa au aratat ca E.coli-LPS a produs efecte negative in perioada post-intarcare alterand performantele purceilor, statusul antioxidant si raspunsul inflamator la nivel local in intestinul subtire (jejun si ileon) si in colon prin activarea citokinelor pro-inflamatoare (IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α) atat la 3 cat si la 11 zile dupa contaminarea cu E.coli-LPS comparativ cu controlul. Ca urmare stresul oxidativ asociat inflamatiei evaluat prin  determinarea peroxidarii lipidice a crescut, iar activitatea enzimelor antioxidante (catalaza, glutationperoxidaza si superoxid dismutaza) a scazut semnificativ in toate cele trei segmente intestinale. Furajul incuzand srot de seminte de rapita fermentat a contracarat efectul bacterian moduland raspunsul pro-inflamator prin scaderea concentratiei de citokine pro-inflamatoare la nivelul controlului. Furajul cu rapita fermentata a ameliorat  performantele de crestere, capacitatea totala antioxidanta si activitatea enzimelor antioxidante la nivel local in intestin.

     Studiile in vivo au scos în evidență potențialul șrotului de rapiță fermentat de a înlocui ZnO sugerând că acesta poate fi o sursă alternativă de compuși bioactivi care pot diminua efectele negative cum sunt inflamația și stresul oxidativ cauzate de înțărcare si de contaminarea cu toxine bacteriene. Cel mai important rezultat al fermentarii a constat in reducerea semnificativa a concentratiilor de factori anti-nutrtitionali (ex. glicozinolati totali si derivati) si in cresterea concentratiei unor compusi bioactivi cum sunt macro- si micorelemente minerale, polifenoli, carbohidrati etc in  srotului fermentat care au rol cheie in cresterea statusului imun de aparare al purceilor dupa intrcare. Costul obtinut per kg furaj al noului produs a fost comparabil cu cel al FC control.

 

MATERIAL DE PROMOVARE PENTRU DISEMNINARE DE CATRE AUTORITATEA CONTRACTANTA

    La nivelul UE, s-a propus retragerea până în 2023 a utilizării oxidului de zinc ca premix de interventie (medicinal), din cauza impactului negativ pe care zincul îl poate avea asupra mediului si cresterii rezistentei bacteriilor patogene. Unele țări europene au interzis deja utilizarea terapeutică a oxidului de zinc la porc, în timp ce în altele, folosirea acestuia nu este încă interzisă. Este nevoie de gasirea unor alternative care sa produca efecte similare fără riscurile problemelor de mediu și rezistenței bacteriene. In acest context proiectul a avut ca obiectiv general dezvoltarea unei noi formule de furaj complet cu potential antimicrobian, bazată pe utilizarea srotului de rapita fermentat.

    Caracterizarea analitica a srotului de rapita fermentat cu Saccharomyces cerevisiae sau Saccharomyces boulardi a pus in evidenta o imbunatatire a calitatii nutritive a srotului fermentat. S-a remarcat scăderea semnificativă a nivelului de glucozinolati (si derivati ai acestora), cei mai importanti factori anti-nutriționali din semnitele de rapita care fac mai putin utilizabil acest subprodus oleaginos in hrana tineretului suin a fost cel mai important rezultat. Concentratia glicozinolatilor a scăzut la jumătate față de șrotul nefermentat (-50,0% pentru SRF-Sc și respectiv -53,97% pentru SRF-Sb), rezultat deosebit de important pentru promovarea utilizarii srotului de rapita in retele de furaj pentru purcei dupa intarcare. Fermentarea cu ambele drojdii a crescut nivelul de proteină brută, fibre și minerale (Fe, Cu, Mn, și Zn), elemente importante pentru imbunatatirea răspunsului imun si diminuarea inflamatie si stresului oxidativ precum si concentrația unor compuși bioactivi ca acizii fenolici (galic, vanilic, p-cumaric si sinapic) acizi grasi polinesaurati, acizi organici (ex. acidul succinic) molecule importante in raspunsul antioxidant. Acidul sinapic, de exemplu, un polifenol specific rapitei, care se numara printre substantele naturale folosite in tratamentele bolilor neurodegenerative a crescut datorita fermentarii de 5,3-7,6 ori, iar acidul p-cumaric, precursor al resveratrolului, unul dintre cei mai puternici antioxidanti de 2,5-3,0 ori.

    Studiile in vitro pe culturi celulare si cele in vivo pe purcei dupa intaracare au scos în evidență potențialul șrotului de rapiță fermentat de a înlocui ZnO sugerând că acest subprodus poate fi o sursă alternativă de compuși bioactivi care pot diminua efectele negative cum sunt inflamația și stresul oxidativ cauzate de înțărcare si de contaminarea cu toxine bacteriene (E.coli LPS). Costul obtinut per kg furaj al noului produs a fost comparabil cu cel al furajului control.