PN-III-P4-PCE-2021-0889

PN-III-P4-PCE-2021-0889

Titlu proiect:

“Abordări in vitro, ex-vivo și in silico pentru identificarea mecanismelor moleculare și celulare implicate în toxicitatea alternariolului“

 

Rezumat

Alternariolul (AOH) este o micotoxină produsă de speciile de Alternaria care provoacă boli ale plantelor din multe culturi și este, de asemenea, responsabilă pentru efectele toxice la om și animale. Cu toate acestea, datele privind toxicitatea AOH și a altor toxine Alternaria sunt destul de rare. Ca urmare a lipsei datelor relevante referitoare la toxicitatea toxinelor produse de Alternaria la animalele de fermă și la om, Autoritatea Europeană pentru Siguranța Alimentară a lansat o solicitare privind colectarea de date  referitoare la gradul de contaminare al cerealelor cu toxine produse de Alternaria și evaluarea efectelor expunerii la aceste toxine prin dieta. Obiectivul general al acestui proiect se bazează pe două argumente și importante: 1) lipsa datelor toxicologice privind efectul AOH la porcine și 2) lipsa datelor privind metabolismul AOH și activitatea biologică a metaboliților săi. În legătură cu aceste argumente, proiectul se va concentra pe două obiective specifice: 1) Evaluarea toxicității celulare in vitro și ex vivo și a căilor moleculare implicate în toxicitatea AOH la porc; 2) Predicția profilului metabolomic al AOH ,al toxicității și activității biologice utilizând metode in silico.

Obiectivul general al prezentului proiect este de a evalua prin studii in vitro și ex vivo, efectele toxice ale alternariolului și de a realiza o predicție a metabolismului AOH și a activității biologice a metaboliților săi în organismul uman/animal folosind abordări in silico.

Etape de realizare

 

Etapa 1/2022 - Studii in vitro. Investigarea efectelor alternariolului asupra cresterii celulare, diviziunii si cailor de semnalizare; predictia metabolitilor alternariolului si descrierea profilului metabolomic

Etapa 2/2023 - Studii ex vivo realizate pe explanturi intestinale

Etapa 3/2024 - Abordari in silico. Evaluarea efectului toxic al alternariolului la nivel intestinal și identificarea mecanismelor responsabile; evaluarea efectelor in silico ale alternariolului prin prediția efectelor toxice, și modelarea interacției alternariol, metaboliti si citocromii P450

Rezultate obținute

 

Etapa 1/2022 In Etapa I a fost analizat efectul alternariolului (AOH) asupra apoptozei și ciclului celular și mecanismelor implicate utilizând culturi de celule din sânge periferic de porc. Concentrațiile mai mari de 50ug/mL de alternariol determină o creștere a procentului de moarte celulară de la 30% la control la 44,7 % indusă de 50ug/mL AOH și respectiv la 47,53% la concentrația de 100ug/mL. Această creștere este corelată cu scăderea semnificativă a procentului de celule vii de la 67,3% la 53,4% pentru 50ug/mL AOH și respectiv 50,3% pentru 100 ug/mL. Nu a fost observată o diferență semnificativă în procentul de celule apoptotice totale, în fază timpurie sau târzie.  AOH induce un arest in faza G2 a ciclului celular începând cu concentrația de 10ug/mL, care este cu atât mai importantă cu cât concentrația de AOH este mai mare.

Predicția produșilor de metaboliților a fost obținută utilizând software-ul MetaTox (http://way2drug.com/mg2/) și a editorului de formule chimice Marvin JS. Au fost identificați produșii de metabolism prefigurați cu ajutorul softului MetaTox rezultați prin reacția de hidroxilare aromatică (metaboliții M1-M3), reacția de O-glucuronidare (metaboliți M4-M6), reacția de S-sulfatare (metaboliții M7-M9) și reacția de metilare (M10-M12) corespunzătoare produselor de fază I și II.

 

Etapa 2/2023 In aceasta etapa am investigat efectele toxice ale alternariotoxinelor (alternariol - AOH si alternariol monomethyl eter – AME) la nivel intestinal utilizând modele in vitro si ex vivo. Pentru studiile in vitro a fost utilizat un model celular reprezentat de celulele IPEC-1(celule epiteliale intestinale) izolate din intestinul subtire al purceilor nou-născuți. Evaluarea efectelor alternariolului asupra cresterii celulare, diviziunii si cailor moleculare de semnalizare in celulele intestinale de porc IPEC1 a fost realizata prin citometrie de flux. Rezultatele noastre au arătat că AOH determină o creștere dependentă de doză a procentului de celule apoptotice și moarte, acompaniată de o creștere a procentului de celule în faza G2. Procesul de apoptoză indus de AOH este mediat de caspazele 3/7 și este corelat cu o scădere a % de celule Bax(+). Expunerea celulelor IPEC1 la alternariotoxine (AOH, AME sau o combinatie a acestora) a determinat un puternic stres oxidativ manifestat printr-o crestere semnificativă, dependentă de doză a concentrației de radicali liberi (ROS). Pentru combinația de toxine, la concentratia mică, efectul a fost similar cu cel al fiecărei toxine administrate individual dar la concentrația mare se observă un efect aditiv sau chiar sinergic al combinației de toxine. Efectul inflamator al AME a fost mai puternic decat cel al AOH, AME inducând sinteza citokinelor pro-inflamatorii IL-6 si IL-8 în experimentele in vitro.  

Pentru realizarea studiilor ex vivo  a fost necesara obținerea unor explanturi intestinale de porc, provenite din jejunul animalelor sanatoase; explanturile au fost ulterior expuse ex vivo la diferite concentratii de toxine (AOH, AME) sau la combinatii ale acestora.  Analiza histologică a mucoasei intestinale în a lotului martor a relevat un aspect normal al mucoasei, respectiv a vilozităților intestinale, a criptelor si corionului. Expunerea la toxinele individuale (AOH/AME sau la combinatia acestora), a relevat o subțiere și o alterare a structurii mucoasei. Se inregistrează pierderea integrității barierei intestinale și o creștere a permeabilizării, favorizând pătrunderea patogenilor și apariția de masive infiltrate imune. Expunerea explantelor intestinale la AOH a determinat o creștere a expresiei proteinei de joncțiune ZO-1, indiferent de concentratia de toxina utilizata. Creșterea determinata de AME a fost mult mai mică, în timp ce co-expunerea explantelor la amestecul de toxine a avut un efect sinergic asupra concentrației proteinei de jonctiune. Expunerea la alternariotoxine a dus pe de-o parte la o cresterea statusului inflamator, asa cum rezulta din  stimularea expresiei genei pentru factorul nuclear NFkb, indiferent de tipul de toxina, concentratia utilizata, sau daca toxinele au fost administrate singure sau in combinatie. Deasemenea,  expunerea la toxine a determinat o crestere semnificativa  a expresiei genice pentru IL-8, o citokină proinflamatoare care are un rol în activarea neutrofilelor și a fost identificată în patogeneza și progresia unor boli. Expunerea la AOH/AME a determinat o scadere a expresiei factorului de transcriptie Nrf2, indiferent de tipul de toxina si de concentratia de toxina utilizata, reprezentand o scadere a capacitatii intestinului de a raspunde stresului oxidativ indus de expunerea la alternariotoxine. Rezultatele obtinute in vitro pe celule IPEC-1 au aratat ca alternariotoxinele induc stres oxidativ prin stimularea sintezei ROS, iar stimularea expresiei genei AKT  indusa de aceste toxine se pare ca determina o cresterii sensibilitatii celulare la moartea mediata de ROS si reprezinta o dovada a faptului ca stresul oxidativ indus de alternariotoxine este mediat prin calea de semnalizare PI3K/AKT/mTOR. In concluzie, rezultatele noastre au aratat ca la nivel intestinal, alternariotoxinele sunt responsabile de inducerea stresului oxidativ si a inflamatiei cu implicarea cailor de semnalizare PI3K/AKT/mTOR si NFkb. De asemenea expunerea la alternariotoxine a determinat o afectare a proteinelor de jonctiune care are ca rezultat alterarea procesului de absorbtie intestinala.

 

Etapa 3/2024 In aceasta etapă au fost realizate teste in vitro (linia de celule epiteliale intestinale de porc -IPEC-1) și ex -vivo (explant de intestin de porc) care au demonstrat că alternariolul afectează integritatea și permeabilitatea epiteliului intestinal prin reducerea rezistentei electrice transepiteliale (TER) și  afectarea proteinelor de jonctiune (claudina si Zo-1)

Abordările in-silico reprezintă un instrument util pentru estimarea toxicității micotoxinelor pentru a prezice toxicitatea, care poate oferi câteva informații preliminare cu privire la efectul toxic al compusului(lor) testat(i) și ar putea oferi un ghid pentru toxicitatea testelor in vitro și in vivo. După cum a prezis software-ul MetaTox, un număr de 12 metaboliți au fost identificați ca corespunzând profilului metabolomic al alternariolului. Studiul nostru raportează pentru prima dată predicția proprietăților fizico-chimice, predicțiile farmacocinetice, asemănarea compuselor și efectele toxice legate de profilul metabolomic al AOH. Profilul ADME pentru AOH și metaboliții previzionați a indicat o probabilitate moderată sau mare de absorbție intestinală pentru AOH și toți metaboliții, cu excepția metaboliților, au rezultat din O-glucuronidare, dar o probabilitate scăzută de a pătrunde în bariera hematoencefalică. După cum rezultă din datele noastre, metaboliții rezultați din reacția de hidroxilare aromatică au obiective toxicologice similare cu compusul de bază, în timp ce metaboliții rezultați din glucuronidare și sulfatare prezintă un profil de toxicitate larg și diferit.

Pe lângă efectele citotoxice, mutagene, carcinogene, perturbatoare endocrine, modelul de calcul a preconizat pentru AOH și a metaboliții săi și alte ținte de toxicitate precum toxicitatea vasculară, hematotoxicitatea, diareea, nefrotoxicitatea. S-a preconizat că AOH și metaboliții săi acționează ca substrat pentru diferite izoforme ale enzimelor de metabolizare a compuselor de faza I și II și interacționează cu răspunsul la stresul oxidativ.

Dintre toți compușii analizați, s-a estimat că AOH și metaboliții rezultați din hidroxilarea aromatică au cele mai multe interacțiuni cu enzimele din Faza I și Faza II. S-a prezis că stresul oxidativ are un rol important în AOH, iar toxicitatea metaboliților acestuia și inhibarea expresiei factorului inductibil 1α de transcripție în hipoxie (HIF1A) care mediază răspunsurile adaptive la stresul oxidativ a fost prezis ca un efect comun pentru toți compușii analizați, sugerând un rol important al căii HIF1A-1α în stresul oxidativ indus de AOH și metaboliții săi.

Toate aceste date privind predicția toxicității pot indica, pe lângă toxicitatea individuală a AOH și a metaboliților săi, un posibil efect de creștere asupra toxicității generale a AOH, deoarece compușii cu moduri comune de acțiune pot acționa în comun pentru a produce efecte de combinație mai mari pe care efectele fiecărui compus. Cu toate acestea, aceste abordări in silico au unele limitări și toate rezultatele prezise ar trebui confirmate în viitor prin teste de toxicitate in vitro și in vivo.

Indicatori de rezultat

Carți: The effects of mycotoxins on human and animal health - A special focus on the cellular and molecular mechanisms responsible for mycotoxin toxicity. 2022. Daniela Eliza Marin and Ionelia Taranu (Editors). Editorial Office MDPI. ISBN 978-3-0365-3028-4, 141 pagini

Articole ISI:

1. Bulgaru V. C, Pistol G. C., Taranu I., Marin D. E. The effects of alternariol mycotoxin on cell cycle and proliferation of porcine blood cells. Scientific Papers. Series D. Animal Science. 2024. LXVII, No. 2, 2024 ISSN 2285-5750; ISSN CD-ROM 2285-5769; ISSN Online 2393-2260; ISSN-L 2285-5750 https://animalsciencejournal.usamv.ro/pdf/2024/issue_2/vol2024_2.pdf
2. Marin D. E., Grosu I. A., Pistol G. C., Bulgaru V. C, Pertea A.M., Taranu I. The combined effect of two Alternaria mycotoxins (alternariol and alternariol monomethyl ether) on porcine epithelial intestinal cells. Agriculture 2024, 14, 1478 https://doi.org/10.3390/agriculture14091478
3. Marin D. E., Bulgaru V. C, Pertea A.M., Grosu I. A., Pistol G. C., Taranu I.. Alternariol Monomethyl-Ether Induces Toxicity via Cell Death and Oxidative Stress in Swine Intestinal Epithelial Cells. Toxins 2024, 16, 223. https://doi.org/10.3390/toxins16050223
4. Marin D.E, Taranu I. 2023. Using in silico approach for metabolomic and toxicity prediction of alternariol. Toxins, 3, 15, 421.doi: 10.3390/toxins15070421
5. Co-contamination of food and feed with mycotoxin and bacteria and possible implication for health. Daniela Eliza Marin, Gina Cecilia Pistol, Cristina Valeria Bulgaru and Ionelia Taranu. Agriculture 2022, 12,1970; https://doi.org/10.3390/agriculture12111970

Conferințe internaționale:

1. Marin D. E., Bulgaru V. C, Pertea A.M., Grosu I. A., Pistol G. C., Taranu I. Effects of individual and combined exposure of swine epithelial intestinal cells to Alternaria 45th Mycotoxin Workshop Vienna, Austria, June 02–05, 2024
2. Marin D. E., Bulgaru V. C, Pistol G. C. Pertea A.M., Taranu I. Assessment of the toxic effect of alternariol monomethyl ether mycotoxin on pig intestinal explants, International Congress “Life Sciences Today for Tomorrow”, Iasi University of Life Science, 24-25 October 2024, Iași, Romania, Congress Book p.147
3. Marin D. E., Pistol G. C, Pertea A.M., Bulgaru V. C, Taranu I. Alternariol mycotoxin induce oxidative stress in porcine explants. “Multidisciplinary Conference on Sustainable Development”, 30 – 31 May 2024, Timisoara, Romania, Book of Abstracts, p. 17
4. Bulgaru V. C, Pertea A.M., Marin D. E., Ionelia Taranu. The prevalence of mycotoxins in the complete feed for farm animals in south-eastern Romania during 2021-2023 period, International Congress “Life Sciences Today for Tomorrow”, 24-25 October 2024, Iași, Romania, Congress Book, p140
5. Marin D. E., Bulgaru V. C, Pertea A.M., Pistol G. C., Taranu I. Assessment of the capacity of alternariol mycotoxin to induce oxidative stress in swine epithelial intestinal cell line IPEC-1. 2^nd Regional Meeting of the European Federation of Animal Science. Nicosia, Cyprus, 24-26 April 2024, Book of Abstract no. 31, 2024, p.42
6. Bulgaru V. C, Pistol G. C., Taranu I., Marin D. E. The effects of alternariol mycotoxin on cell cycle and proliferation of porcine blood cells. Conference “Agriculture for Life, Life for agriculture“. June 6-8, 2024, Bucharest, Romania, Book of Abstracts, p.60
7. Bulgaru C, Pistol G.C, Taranu I, Marin D.E. 2023. The effects of mycotoxin alternariol on cell growth, division and cell cycle in porcine peripheral blood morphonuclear cells. EAAP Regional Meeting, 26-28 apr Nitra, Slovakia
8. Marin D.E., Pistol G.C, Bulgaru C, Taranu I, 2023.Effect of Alternaria mycotoxin- alternariol monomethyl-ether- on cell proliferation, apoptosis and death of swine IPEC 1 cell line. 44th Mycotoxin-Workshop 5-7 iun 2023, Celle Germania
9. Marin D.E., Pistol G.C, Bulgaru C, Taranu I, 2023.Assessment of the effect of alternariol mycotoxin on swine intestinal parameters using an explant model. 44th Mycotoxin-Workshop 5-7 iun 2023, Celle Germania
10. Marin D.E., Taranu I,. 2023. Metabolomic and toxicity prediction of alternariol using in silico approaches. 17th International Symposium of Animal Biology and Nutrition, 29 sept. Balotesti, Romania
11. Pertea AM, Bulgaru C, Pistol G.C, Taranu I, Marin D.E. 2023.The role of alternariol in the apoptotic process at the gut level in pigs. 17th International Symposium of Animal Biology and Nutrition, 29 sept. Balotesti, Romania