PN-III-P4-PCE-2021-0889

PN-III-P4-PCE-2021-0889

Titlu proiect:

Abordări in vitro, ex-vivo și in silico pentru identificarea mecanismelor moleculare și celulare implicate în toxicitatea alternariolului

Rezumat

Alternariolul (AOH) este o micotoxină produsă de speciile Alternaria care provoacă boli ale plantelor din multe culturi și este, de asemenea, responsabilă pentru efectele toxice la om și animale. Cu toate acestea, datele privind toxicitatea AOH și a altor toxine Alternaria sunt destul de rare. Ca urmare a lipsei datelor relevante referitoare la toxicitatea toxinelor produse de Alternaria la animalele de fermă și la om, Autoritatea Europeană pentru Siguranța Alimentară a lansat o solicitare privind colectarea de date  referitoare la gradul de contaminare al cerealelor cu toxine produse de Alternaria și evaluarea efectelor expunerii la aceste toxine prin dieta. Obiectivul general al acestui proiect se bazează pe două argumente și importante: 1) lipsa datelor toxicologice privind efectul AOH la porcine și 2) lipsa datelor privind metabolismul AOH și activitatea biologică a metaboliților săi. În legătură cu aceste argumente, proiectul se va concentra pe două obiective specifice: 1) Evaluarea toxicității celulare in vitro și ex vivo și a căilor moleculare implicate în toxicitatea AOH la porc; 2) Predicția profilului metabolomic al AOH ,al toxicității și activității biologice utilizând metode in silico. Proiectul va furniza noi date științifice (toxicitatea unui contaminant furaj mai puțin studiat), cu aplicabilitate în industria furajelor și de mare importanță pentru sănătate.

Obiectivul general al prezentului proiect este de a evalua prin studii in vitro și ex vivo, efectele toxice ale alternariolului și de a realiza o predicție a metabolismului AOH și a activității biologice a metaboliților săi în organismul uman/animal folosind abordări in silico.

 

Etape de realizare

Etapa 1/2022 - Studii in vitro. Investigarea efectelor alternariolului asupra cresterii celulare, diviziunii si cailor de semnalizare; predictia metabolitilor alternariolului si descrierea profilului metabolomic

Etapa 2/2023 - Studii ex vivo realizate pe explanturi intestinale

Etapa 3/2024 - Abordari in silico. Evaluarea efectului toxic al alternariolului la nivel intestinal și identificarea mecanismelor responsabile; evaluarea efectelor in silico ale alternariolului prin prediția efectelor toxice, și modelarea interacției alternariol, metaboliti si citocromii P450

Rezultate obținute

Etapa 1/2022 In această etapă a fost analizat efectul alternariolului (AOH) asupra apoptozei și ciclului celular și mecanismelor implicate utilizând culturi de celule din sânge  periferic de porc.

Predicția produșilor de metaboliților a fost obținută utilizând software-ul MetaTox (http://way2drug.com/mg2/) și a editorului de formule chimice Marvin JS. Au fost identificați produșii de metabolism prefigurați cu ajutorul softului MetaTox rezultați prin reacția de hidroxilare aromatică (metaboliții M1-M3), reacția de O-glucuronidare (metaboliți M4-M6), reacția de S-sulfatare (metaboliții M7-M9) și reacția de metilare (M10-M12) corespunzătoare produselor de fază I și II.

 

Etapa 2/2023 In aceasta etapa am investigat efectele toxice ale alternariotoxinelor (alternariol - AOH si alternariol monomethyl eter – AME) la nivel intestinal utilizând modele in vitro si ex vivo. Obiectivele și activitățile propuse în aceasta etapa a proiectului au fost realizate totalitate (100%).

Pentru studiile in vitro a fost utilizat un model celular reprezentat de celulele IPEC-1(celule epiteliale intestinale) izolate din intestinul subtire al purceilor nou-născuți. Evaluarea efectelor alternariolului asupra cresterii celulare, diviziunii si cailor moleculare de semnalizare in celulele intestinale de porc IPEC1 a fost realizata prin citometrie de flux. Rezultatele noastre au arătat că AOH determină o creștere dependentă de doză a procentului de celule apoptotice și moarte, acompaniată de o creștere a procentului de celule în faza G2. Procesul de apoptoză indus de AOH este mediat de caspazele 3/7 și este corelat cu o scădere a % de celule Bax(+). Expunerea celulelor IPEC1 la alternariotoxine (AOH, AME sau o combinatie a acestora) a determinat un puternic stres oxidativ manifestat printr-o crestere semnificativă, dependentă de doză a concentrației de radicali liberi (ROS). Pentru combinația de toxine, la concentratia mică, efectul a fost similar cu cel al fiecărei toxine administrate individual dar la concentrația mare se observă un efect aditiv sau chiar sinergic al combinației de toxine. Efectul inflamator al AME a fost mai puternic decat cel al AOH, AME inducând sinteza citokinelor pro-inflamatorii IL-6 si IL-8 în experimentele in vitro.  

Pentru realizarea studiilor ex vivo  a fost necesara obținerea unor explanturi intestinale de porc, provenite din jejunul animalelor sanatoase; explanturile au fost ulterior expuse ex vivo la diferite concentratii de toxine (AOH, AME) sau la combinatii ale acestora.  Analiza histologică a mucoasei intestinale în a lotului martor a relevat un aspect normal al mucoasei, respectiv a vilozităților intestinale, a criptelor si corionului. Expunerea la toxinele individuale (AOH/AME sau la combinatia acestora), a relevat o subțiere și o alterare a structurii mucoasei. Se inregistrează pierderea integrității barierei intestinale și o creștere a permeabilizării, favorizând pătrunderea patogenilor și apariția de masive infiltrate imune. Expunerea explantelor intestinale la AOH a determinat o creștere a expresiei proteinei de joncțiune ZO-1, indiferent de concentratia de toxina utilizata. Creșterea determinata de AME a fost mult mai mică, în timp ce co-expunerea explantelor la amestecul de toxine a avut un efect sinergic asupra concentrației proteinei de jonctiune. Expunerea la alternariotoxine a dus pe de-o parte la o cresterea statusului inflamator, asa cum rezulta din  stimularea expresiei genei pentru factorul nuclear NFkb, indiferent de tipul de toxina, concentratia utilizata, sau daca toxinele au fost administrate singure sau in combinatie. Deasemenea,  expunerea la toxine a determinat o crestere semnificativa  a expresiei genice pentru IL-8, o citokină proinflamatoare care are un rol în activarea neutrofilelor și a fost identificată în patogeneza și progresia unor boli. Expunerea la AOH/AME a determinat o scadere a expresiei factorului de transcriptie Nrf2, indiferent de tipul de toxina si de concentratia de toxina utilizata, reprezentand o scadere a capacitatii intestinului de a raspunde stresului oxidativ indus de expunerea la alternariotoxine. Rezultatele obtinute in vitro pe celule IPEC-1 au aratat ca alternariotoxinele induc stres oxidativ prin stimularea sintezei ROS, iar stimularea expresiei genei AKT  indusa de aceste toxine se pare ca determina o cresterii sensibilitatii celulare la moartea mediata de ROS si reprezinta o dovada a faptului ca stresul oxidativ indus de alternariotoxine este mediat prin calea de semnalizare PI3K/AKT/mTOR. In concluzie, rezultatele noastre au aratat ca la nivel intestinal, alternariotoxinele sunt responsabile de inducerea stresului oxidativ si a inflamatiei cu implicarea cailor de semnalizare PI3K/AKT/mTOR si NFkb. De asemenea expunerea la alternariotoxine a determinat o afectare a proteinelor de jonctiune care are ca rezultat alterarea procesului de absorbtie intestinala.

Rezultate obtinute:

Articol ISI

Marin D.E, Taranu I. 2023. Using in silico approach for metabolomic and toxicity predic-tion of alternariol. Toxins, 3, 15, 421.doi: 10.3390/toxins15070421

Conferinte Internaționale

Bulgaru C, Pistol G.C, Taranu I, Marin D.E. 2023. The effects of mycotoxin alternariol on cell growth, division and cell cycle  in porcine peripheral blood morphonuclear cells. EAAP Regional Meeting, 26-28 apr Nitra, Slovakia

Marin D.E., Pistol G.C, Bulgaru C, Taranu I, 2023.Effect of Alternaria mycotoxin- alternariol monomethyl-ether- on cell proliferation, apoptosis and death of swine IPEC 1 cell line. 44th Mycotoxin-Workshop 5-7 iun 2023, Celle Germania

Marin D.E., Pistol G.C, Bulgaru C, Taranu I, 2023.Assessment of the effect of alternariol mycotoxin on swine intestinal parameters using an explant model. 44th Mycotoxin-Workshop 5-7 iun 2023, Celle Germania

Marin D.E., Taranu I,. 2023. Metabolomic and toxicity prediction of alternariol using in silico approaches. 17th International Symposium of Animal Biology and Nutrition, 29 sept. Balotesti, Romania

Pertea AM, Bulgaru C, Pistol G.C, Taranu I, Marin D.E. 2023.The role of alternariol in the apoptotic process at the gut level in pigs. 17th International Symposium of Animal Biology and Nutrition, 29 sept. Balotesti, Romania

Bulgaru C, Pertea AM, Pistol G.C, Taranu I, Marin D.E. 2023. Ex-vivo studies on the effects of Alternaria toxins on the inflammatory response at the porcine intestinal level. 17th International Symposium of Animal Biology and Nutrition, 29 sept. Balotesti, Romania

 

PREVIOUS

PN-III-P4-PCE-2021-0992

NEXT

PN-III-P2-2.1-PED-2021-2001