Proiectul NUTRIMICODIM

Proiect NUTRIMICODIM
51-122 / 2008 (PNCDI 2)

Director proiect: Ionelia TARANU

Asigurarea securitatii si calitatii resurselor furajere si produselor animaliere prin solutii nutritionale de diminuare a efectelor negative ale unor micotoxine, contaminanti naturali ai hranei animalelor de ferma si omului.

Consortiul proiectului:

1. CO - Institutul National de Cercetare Dezvoltare pentru Biologie si Nutritie Animala Balotesti.
2. P1 - Institutul National de Cercetare-Dezvoltare Chimico-Farmaceutica Bucuresti.
3. P2 - Institutul National de Cercetare-Dezvoltare in Domeniul Patologiei si Stiintelor Biomedicale Victor Babes
4. P3 - S.C. SIAT SA
5. P4- Centrul de Biochimie Aplicata si Biotehnologii BIOTEHNOL Bucuresti
6. P5- Universitatea de Stiinte Agricole si Medicina Veterinara a Banatului Timisoara

Rezumatul Proiectului

Obiectivul general al prezentului proiect este investigarea potentialului decontaminant al unor sinbionti (combinatii de prebiotice selectionate si probiotice obtinute prin biotehnologii moderne) in a diminua efectul toxic al unor micotoxine ale genului Fusarium, contaminanti naturali in lantul alimentar in tarile europene cu climat temperat, si elaborarea de noi solutii nutritionale capabile sa imbunatateasca siguranta si calitatea hranei animalelor de ferma si a produselor de origine animala. Subiectul proiectului este in concordanta cu reglementarea UE 1881/2006 care interzice utilizarea metodelor chimice si termice in diminuarea contaminantilor din hrana. Proiectul va combina studii in vitro (culturi celulare cu diferite tipuri de celule de porc si umane) si in vivo (experiente pe porc) precum si studii privind mecanismele de actiune la nivel molecular al micotoxinelor si decontaminatilor folositi pe baza carora va elabora strategii de hranire (formule de recepturi de hrana si recomandari nutritionale) eficiente in decontaminare. Nutrimicodim este un proiect de colaborare multidisciplinar care reuneste competente cu expertiza excelenta in chimie-farmacie, histologie, imunologie-patologie, nutritie si statistica provenind din institutii de prestigiu din Romania si care va aborda o cercetare complementara integrata capabila sa raspunda nevoilor cerecetarii din acest domeniu.

Proiectul este structurat in 6 etape insumand 24 activitati care vor analiza proprietatile unor prebiotice, probiotice si sinbionti de a reduce toxicitatea micotoxinelor genului Fusarium. Cercetari recente au pus in evidenta efectul benefic al sinbiontilor, combinatii de probiotice (lacotobacili si drojdii) si prebiotice (in special oligozaharide pe baza de fructan) care au avantajul actiunii sinergice a celor doua, stimulind selectiv microflora benefica indigena si crescind potentialul de aparare si de rezistenta al organismului animal si uman. In ciuda numeroaselor evidente stintifice nationale si internationale care au demonstrat rolul benefic al pre- si probioticelor, multe aspecte sunt inca nerezolvate pe plan national si international legate mai ales de intelegerea mecanismelor lor de actiune la nivel celular si molecular; studii suplimentare sunt necesare pentru investigarea efectului lor in combinatii si pentru stabilirea ratei optime de includere in hrana. Cunoasterea acestor mecanisme va constitui un atu si o baza stiintifica in elaborarea de strategii de hranire (formule de recepturi) eficiente in combaterea toxicitatii unor micotoxine Fusarium. Proiectul de fata va investiga efectul unor noi combinatii de sinbionti incluzind probiotice pe baza de drojdii ca Sacharomyces imbogatite in cupru (Cu) si zinc (Zn), microelemente cu rol puternic antioxidant si Rhodotorula rubra (specie de drojdii cu structura complexa continind pe linga pachetul enzimatic eficient specific drojdiilor, o serie de pigmenti antioxidanti carotenoidici, ca b -caroten, torulen si torularhodin cu rol important in reactiile oxidative si transferurile membranare) si prebiotice (oligozaharide pe baza de fructan, ex. inulina) in reducerea toxicitatii micotoxinelor. Prin studiile intreprinse proiectul va contribui la: 1) dezvoltarea cunostiintelor in nutritie si micotoxicologie prin constituirea unei baze stiintifice teoretice (informatii stiintifice) si practice (noi formule si recepturi de hrana) privind utilizarea de suplimente nutritive naturale eficiente in diminuarea toxcitatii unor micotoxine si 2) o mai buna intelegere a mecanismelor de actiune a micotoxinelor si detoxifiantilor la nivel sistemic si mai ales local, in intestin. In scopul evaluarii eficientei biopreparatelor detoxifiante vor fi utilizate doua abordari de cercetare complementare, o abordare celulara in vitro in care prin studii pe culturi de celule intestinale epiteliale se va analiza efectul lor asupra apararii locale, la nivelul intestinului, una dintre cele mai importante bariere de aparare a organismului si situsul de absorbtie al nutrientilor din hrana si mecanismele moleculare care stau la baza interactiilor cu micotoxinele si o abordare integrata in vivo in experimente pe porci care vor valida rezultatele obtinute in vitro. Rezultatele proiectului vor avea un impact economic prin (i) valorificarea superioara a noi produse obtinute prin biotehnologii moderne, (ii) elaborarea de solutii nutritionale care asigura calitatea si siguranta produselor de origine animala, (iii) cresterea productivitatii ca o consecinta a imbunatatirii starii de sanatate a animalelor, si un impact social prin cresterea calitatii vietii ca rezultat al obtinerii de produse alimentare sigure din punct de vedere sanitar si de mediu. Rezultatele vor fi diseminate atit in demonstratii organizate impreuna cu oficiile ale Agentiei Nationale de Consultanta Agricola cit si prin alte metode in scopul sensibilizarii opiniei publice asupra pericolului contaminarii cu micotoxine al lantului alimentar.

Cuvinte cheie: Nutritie, contaminanti, sinbionti, porc, mediu.

Etapele proiectului:

Etapa I

Evaluarea bibliografica a utilizarii in vitro si in vivo a sinbiontilor ca decontaminanti ai micotoxinelor; screeningul si selectionarea unor simbionti (pre- si probiotice) eficienti in decontaminarea micotoxinelor.

Etapa II

Obtinerea, caracterizarea probioticului 1 (PBR) si evaluarea efectului la nivel celular si molecular

Etapa III

Screeningul, selectionarea tulpinilor si obtinera probioticului 2- PBS (Sacharomyces imbogatite in microelemente antioxidante) in scopul realizarii de complexe sinbiotice cu potential decontaminant.

Etapa IV

Evaluarea eficientei probioticului 2 (PBS) si in combinatii de sinbionti in diminuarea toxicitatii micotoxinelor prin studii in vitro la nivel celular si molecular.

Etapa V

Obtinerea la nivel micropilot a probioticelor PBR si PBS in vederea evaluarii eficientei lor in diminuarea contaminarii cu micotoxine.

Etapa VI

Evaluarea capacitatii decontaminante a pre-, probioticelor si sinbiontilor in experimente in vivo pe porc in comparatie cu produse similare de import (ex. Alltech).

Conform planului de realizare, in etapa I a proiectului au fost indeplinite urmatoarele activitati:

• Realizarea unui studiu documentar privind Evaluarea bibliografica a uilizarii in vitro si in vivo a sinbiontilor ca decontaminanti ai micotoxinelor; pe baza acestui studiu au fost selectionate o serie de prebiotice ( inulina, pectina, celuloza, hemi-celuloza ) si probiotice ( Rhodotorula rubra , Sacharomyces cerevisae ) care vor fi testate in combinatiile de sinbionti in proiect;
• Selectionarea a doua tulpini de Rhodotorula rubra in vederea obtinerii Probioticului 1 ce va fi utilizat in experimentele din proiect, utilizand medii de cultura selective;
• Studierea influentei parametrilor de cultivare asupra acumularii biomasei de drojdii la nivel laborator: temperatura, pH si incorporare de metale (Cu, Zn, Mn). Acest studiu a demonstrat ca temperatura de 28 0 C, pH-ul initial al mediului de cultura de 6.5 si o rata de agitare de 240 rpm, au fost parametrii care au contribuit la obtinerea unei concentratii de biomasa ridicata > 20 g/l cu un continut crescut de pigmenti carotenoidici ca caroten >.500 g/g s.u; s-a demonstrat ca viteza de crestere in prezenta cuprului, zincului si manganului este putin mai mica comparativ cu cea obtinuta in mediu fara adaos de ( max = 0,09h -1 fata de 0,1 h -1 pentru martor).
• Realizarea unui studiu documentar privind determinarea analitica a micotoxinelor din medii de culturi celulare.

Experimentele derulate in etapa a II a a proiectului au condus la obtinerea urmatoarelor rezultate:

• Realizarea tehnologiei de obtinere a probioticului 1, respectiv a drojdiei Rhodotorula rubra ICCF 384 adaptata la cultivarea in prezenta de minerale la nivel de laborator a aratat ca: (i) cultura de drojdie s-a dezvoltat masiv in cca. 24 ore atingând un maxim la cca. 50 ore; (ii) dupa cca.20-24 ore mediul de cultura a fost puternic acid necesitând o corectie de pH pentru a putea continua dezvoltarea in conditii optime; (iii) dupa cca. 40 de cultivare s-a constatat ca microorganismul a consumat sursa de zahar, fapt care a necesitat o suplimentare in urma careia nu s- a inregistrat o reluare imediata a dezvoltarii microorganismului, insa procesul de carotenogeneza a fost reluat; (iv) nivelul de captare al mineralelor adaugate in mediul de cultura a fost superior celor obtinute in faza de testare si am concluzionat ca este posibila chiar o usoara imbunatatire a acestuia; (v)
• Toate experimentele realizate in aceasta etapa pe culturi de celule in vitro sugereaza ca micotoxinele deoxinivalenol (DON) si zearalenona (ZEN) afecteaza importanti parametri ai raspunsului imun atat in limfocitele din sangele periferic (PBMC) cat si in celulele epiteliale intestinale umane si de porc: proliferarea celulara, sinteza unor citokine (IL-8), integritatea celulara (TEER). PBMC activate au fost mai susceptibile la actiunea citotoxica a micotoxinei. PBMC umane au fost mai reactive decat cele de porc la actiunea toxica a micotoxinei; ZEN nu afecteaza esential procentul de limfocite T CD4+ sau CD8+ in cazul in care celulele nu sunt activate sau sunt slab stimulate experimental; ZEN tinde sa reduca la concentratii mai (50 M) procentul de limfocite T CD4+, atunci cand acestea sunt activate experimental cu Con A; folosind modelul experimental de simulare a barierei intestinale s-a demonstrat ca DON-ul si ZEN-ul afecteaza functia de bariera a epiteliului intesinal prin scaderea rezistentei electrice membranare; determinarile cantitative nu au confirmat prezenta DON-lui in interiorul celulelor. Absenta micotoxinei poate fi si consecinta faptului ca nivelul acesteia in celule se situeaza sub limita de detectie a metodei (0,06 µg/ml), sau a ineficientei procedeelor aplicate pentru spargerea celulelor; valorile obtinute la determinarea DON din supernatant de coreleaza cu nivelul de micotoxina adaugat in mediul de cultura. Corelarea este mai evidenta in cazul primul experiment.

Experimentele derulate in etapa a III a a proiectului au condus la obtinerea urmatoarelor rezultate:

• Folosind modelul experimental de simulare a barierei intestinale au fost testate prebiotice pe baza de fructan (inulina, pectina), iar ca probiotice o tulpina de drojdii, Rhodotorula rubra (PBR) imbogatita in microelemente (cupru (Cu), zinc (Zn) si mangan (Mn)). Tehnica inserturilor prin filtrele cu membrana poroasa inserate in placile de cultura permit formarea a doua compartiemente, iar celulele epiteliale cultivate pe aceste filtre conflueaza pe membrana poroasa formind jonctiuni seroase care le confera proprietati de epiteliu intestinal, cu un pol basal ( compartimentul luminal ) si unul apical ( compartimentul sistemic-circulatia sanguina) . In acest microsistem au fost analizate efectul individual si in combinatii al inulinei si Rhodotorulei in prezenta de micotoxine asupra unor parametri importanti pentru fiziologia celulara. Rezultatele experimentale au aratat ca cea mai promitatoare varianta in cazul raspunsului local a fost combinatia sinbiotica inulina plus Rodothorula , la concetratii de 0,5 mg/mL, 0,75 si respectiv 1 mg/mL, concentratii care au determinat o crestere semnificativa a activitatii metabolice ala celulelor epiteliale IPEC-1. Combinatia de simbionti nu a influentat efectul citotoxic al micotoxinei la nivel sistemic, respecitv asupra celulelor din sangele periferic porcin (PBMC). Cel de al doilea prebiotic testat (pectina) nu a produs o influenta asupra activtiatii celulare nici individual nici in combinatia cu Rodhotorula rubra ;
• Rezultatele experimentelor in vitro in culturi de limfocite porcine au relevat faptul ca micotoxinele ZEN si -ZOL exercita in vitro un efect anti-proliferativ asupra limfocitelor periferice de porc. Efectul este dependent de calea de activare a acestora, respectiv de implicarea TCR si, posibil, a monocitelor; adaosul de prebiotic- inulina in absenta/sau prezenta unor concentratii mici de ZEN a aratat ca: (i) in absenta micotoxinei inulina tinde sa stimuleze activitatea granulocitelor periferice activate experimental de E. coli , dovedindu-se astfel potentialul imunomodulator al inulinei; (ii) in prezenta zearalenonei, inulina a limitat activitatea oxidativa intracelulara dezvoltata de granulocitele periferice activate experimental cu E. coli in prezenta de ZEN; (iii) inulina singura nu a putut contracare actiunea inhibitoare a micotoxinei ZEN asupra proliferarii si activarii limfocitelor periferice de porc; (iv) combinatia de Rhodotorula si inulina a manifestat in vitro o actiune imunomodulatoare asupra granulocitelor periferice de porc:

  • o tendinta de stimulare activitatea oxidativa intracelulara a granulocitelor periferice cu reactivitate normala la E. coli , indiferent daca acestea au fost sau nu tratate cu micotoxina ZEN;
  • o tendinta de limitare a intensitatii activitatii oxidative a granulocitelor periferice hiperreactive la E. coli , indiferent daca acestea au fost sau nu tratate cu micotoxina ZEN.
• Studiile de viabilitate celulara a Rhodotorula rubra ICCF 384 au relevat o viabilitate celulara mai scazuta in cazul adaosului mai multor elemente minerale decat in cazul adaosului in mediu de cultura a unui singur element metalic ceea ce a necesitat optimizarea parametrilor de cultivare;
• Studiul parametrilor de cultivare si al modului de adaos al mineralelor a aratat ca adaosul in trepte al mineralelor, completarea mediului cu un amestec de vitamine si prelungirea duratei bioprocesului conduc la obtinerea unor rezultate mai bune in privinta nivelului de biomasa rezultata si in special in privinta nivelului de biosinteza al pigmentilor carotenoidici;
• Realizarea si experimentarea modelului tehnologic in conditiile stabilite prin testele de optimizare au condus la obtinerea de biomasa de Rh. rubra imbogatita cu minerale (cupru, zinc si mangan) cu proprietati similare si in cantitati relativ egale respectiv: 25-26g su. pe experiment, cu un continut in pigmenti carotenoidici decca. 210-220 g/g su exprimati in - caroten si un nivel de captare al zincului de 104-106ppm, al cuprului de 20-40ppm si al manganului de 20-40 ppm;
• S-a stabilit un set de metode care permit identificarea principalilor parametri de interes ai unui preparat de tip probiotic pe baza de drojdii si stabilirea nivelului de acceptabilitate al acestor produse. Metodele aplicate cuprind: determinarea continutului in substanta uscata, continutului in pigmentii carotenoidici biosintetizati si determinarea continutului in mineralele captate. Aceste determinari alaturi de aspect, miros, culoare, puritate microbiologica constituie elementele de baza ale unei Fise analitice de produs propusa pentru preparatele probiotice pe baza de Rh.rubra imbogatita cu minerale;
• Investigatiile vor continua cu analiza efectului combinatiilor de pre- si probiotice in experimentele in vivo prevazute in planul de realizare al proiectului.

Lucrari si comunicari stiintifice realizate in cadrul proiectului:

Carti

Taranu I, Marin DE Tabuc C., 2009. Mucegaiuri si micotoxine. Efectul micotoxinelor la porc. Editura Ars Docendi, 2009

Lucrari ISI

Taranu I, Marin DE et al. 2010. Comparative aspects of in vitro proliferation of human and porcine lymphocytes exposed to mycotoxins . Archives of Animal Nutrition, 2010, 64 (5) 383 393.

Marin DE , Taranu I. 2010. Effects of zearalenone and its derivatives on the innate immune response of swine. et al., 2010. Toxicon, 2010, 56, 956-963

Taranu I, Marin DE . et al., 2010. Assesment of the potential of a natural fructose additive in counteracting the toxic effect of Fusarium mycotoxins. British Journal of Nutrition, 2010 (in press)

Lucrari cotate CNCSIS

Marin DE, Taranu I et al. 2010. Optimal cell culture conditions for IgG synthesis by swine peripheral blood mononuclear cells, Buletin of University of Agricultural Sciences and Verinary Medicine Cluj-Napoca, 2010, 67, (1-2), 466.

Lucrari de popularizare

Marin DE, Taranu I et al. 2010. Metode de contracarare a toxicitatii micotoxinelor. Revista de Zootehnie, 1, 58-61

Congrese si simpozioane interne si internationale :

Marin D.E.,Taranu I., Motiu M., Stancu M, Calin L. 2010. Comparative effects of zearalenone and its metabolites on the swine cells involved in the acquired immune response. Al IX-lea Simpozion International al INCDBNA, 23-24 septembrie, 56

Marin D.E, Taranu I., Tabuc C.2010. Effect of Fusarium toxins on epithelial porcine cells a 3 a editie a Workshop-ului :"Fungi si micotoxine in lantul alimente-animale-om", 7 nov, USAMV Bucuresti

F. Israel-Roming, Taranu I, Marin D., Gherghina E., Balan D. 2010. Is deoxynivalenol absorbed at intestinal level? 3rd International Symposium New Researches in Biotehnology, 17-18 nov.

Radulescu G, Barbulescu DI et al. 2009. Screening of Rhodotura rubra strains resistant to manganese, zinc and copper for the production of probiotics for animal nutrition. Proceeding of the third International IUPAC symposium on trace elements in food, Roma, Italia, martie 2009; ISSN-0393 5620