Proiectul POSDRU/89/1.5/S/63258

POSDRU/89/1.5/S/63258, nr.246053
Utilizarea unor biotehnologii alimentare in combaterea contaminatilor alimentari in scopul asigurarii securitatii si sigurantei alimentare la oameni si animale.

Obiectivele proiectului:

Obiectivul general al proiectului consta in investigarea potentialului decontaminant al unor biotehnologii alimentare in diminuarea efectului toxic al unor contaminanti naturali ai lantul alimentar in scopul elaborarii de noi solutii nutritionale capabile sa imbunatateasca siguranta si calitatea hranei animalelor de ferma si a produselor de origine animala. Obiectivele specifice ale proiectului sunt: (i) screening-ul si selectionarea de probiotice pe baza de bacterii acidolactice si drojdii obtinute prin biotehnologii moderne(ii) evaluarea in vitro al efectului detoxifiant al probioticelor la nivel celular pe culturi de celule sanguine porcine contaminate sau nu cu concentratii scazute de micotoxine (iii) evaluarea in vitro a modificarii permeabilitatii intestinale, integritatii si functionalitatii barierei intestinale in urma actiunii micotoxinelor si al efectului detoxifiant al probioticelor utlizand un model celular de simulare in vitro a barierei intestinale (iv) evaluarea in vivo (experimente pe purcei dupa intarcare) a eficientei probioticelor selectionate pe baza rezultatelor in vitro (v) determinarea mecanismelor prin care probioticele moduleaza.

1. Contaminanti ai furajelor: Micotoxine

Micotoxinele sunt metaboliti secundari toxici sintetizati de mucegaiuri, care pot afecta grav sanatatea omului si a animalelor (Rotter si colab., 1996; Manon si Johnson, 1985). Notiunea de metabolit secundar se refera la acei compusi rezultati din metabolismul secundar al ciupercilor, care nu sunt necesari dezvoltarii microorganismului, dar sunt o consecinta importanta a procesului de crestere, formandu-se in stadiile finale ale fazei de crestere exponentiala a ciupercii (Jay, 2000). Acesti compusi secundari, toxici, sunt cunoscuti sub denumirea generica de micotoxine si se considera ca au aparut in decursul procesului evolutiei filogenetice a micromicetelor ca un mijloc de aparare al acestora (Le Bars si colab., 1988). Spre deosebire de metabolismul primar fundamental, acelasi pentru toate fiintele vii, metabolismul secundar depinde de specie si este foarte important in cazul mucegaiurilor, conducand la sinteza unui foarte mare numar de molecule printre care se numara si micotoxinele. Micotoxinele sunt elaborate in cele mai diverse substraturi (cereale, masa foliacee a plantelor aflate in faza de vegetatie, inclusiv in plantele medicinale, boabe de leguminoase, fructe, condimente etc); ele pot fi prezente in produse de origine animala (lapte, branzeturi fermentate, oua, carne) sub forma de reziduuri provenite de la animale hranite cu furaje contaminate sau prin contaminarea ulterioara a acestor produse cu micromicete toxinogene.

Contaminarea cu mucegaiuri, dezvoltarea lor si producerea de micotoxine poate avea loc in camp, in timpul depozitarii sau in ambele perioade. In timpul depozitarii cerealelor are loc o pierdere a continutului de proteine, aminoacizi, vitamine etc, fapt ce conduce la scaderea valorii nutritive a boabelor. In aceste conditii ele devin mai vulnerabile atacului fungilor si insectelor. Prezenta mucegaiurilor nu inseamna neaparat sinteza de micotoxine, producerea acestora fiind conditionata de mai multi factori fizici si chimici (De Mello si MacDonald, 1997) cum sunt schimbari de temperatura, umiditate, aerare, prezenta agentilor agresivi si de stres (Jay, 2000). Mucegaiurile micotoxinogene, care se dezvolta in camp (necesita un grad mare de umiditate) apartin genurilor Alternaria, Fusarium, Cladosporium, in timp ce micoflora de stocaj (care necesita mai putina umezeala) este reprezentata, in principal, de genurile Aspergillus si Penicillium. Conditiile de contaminare a unui substrat de catre o ciuperca si elaborarea micotoxinelor sunt multiple si complexe. Cunoasterea factorilor care intervin in dezvoltarea fungilor este esentiala pentru intelegerea mecanismelor contaminarii si poate usura prevenirea elaborarii micotoxinelor.

Micotoxinele majore cunoscute pentru intoxicatiile severe pe care le produc la om si animale sunt sintetizate, in principal, de 5 genuri importante de ciuperci: Aspergillus, Penicillium, Fusarium, Alternaria si Claviceps (Miller si Trenholm, 1994; Sweeney si Dobson, 1998).

In cele ce urmeaza vor fi prezentate aspecte generale privitoare la toxicitatea celor mai importante clase de micotoxine:

1. AFLATOXINE

Aflatoxinele sunt considerate unele dintre cele mai puternice toxine naturale fiiind singurele micotoxine clasificate de Agentia internationala pentru cancer (IARC-International Agency for Research in Cancer) in grupul 1 al substantelor carcinogene pentru om. Toxicitatea aflatoxinelor (AF) depinde de factori cum ar fi varsta, sexul, specia, starea fiziologica a animalului, calea de administrare, compozitia hranei (Castegnaro si Pfohl-Leszkowicz, 1999; Robens si Richard, 1992). Masculii sunt de doua ori mai sensibili decat femelele, iar animalele tinere, in particular noii nascuti, sunt mai sensibile decat adultii (Cahagnier, 1998).

Toxicitatea acuta

Toxicitatea acuta a aflatoxinelor a fost demonstrata de multa vreme la porc ca si la alte specii de mamifere, pasari si pesti (Cahagnier si colab., 1998; Coulombe si colab., 1993; Wogan si colab., 1992). Prin studiile experimentale de intoxicare acuta s-au putut urmari aparitia si evolutia leziunilor hepatice intr-un interval de 72 de ore de la ingestia de doze mari de aflatoxina. Manifestarile clinice observate dupa adminsitrarea experimentala a unei doze unice de 1,98 mg AFB1/kg pura sau a unui amestec de aflatoxine (AFB1 57%, AFG1 37%, AFB2 si AFG2 urme) per kilogram greutate vie la purcei de 10-20 kg au fost identice cu cele observate in ferme. Alterarea starii generale si pierderea apetitului este manifestarea clinica dominanta in cazul intoxicarilor acute. Animalele afectate prezinta o diminuare a performantelor, a productiei de carne, o temperatura corporala sub-normala, edem al extremitatilor inferioare, dureri abdominale, hemoragie si vomismente (Williams si colab., 2004; Bennet si Klich, 2003).

Toxicitatea cronica

Manifestarile clinice ale unei toxicitati cronice la porc produse de aflatoxine sunt dominate de diminuarea consumului de hrana si a sporului in greutate; reducerea greutatii corporale e considerata ca fiind efectul cel mai comun asociat cu aflatoxicoza cronica; animalele manifesta o alterare a starii lor generale care evolueaza catre atonie musculara si astenie sau cresterea frecventei imbolnavirilor, chiar in absenta semnelor clinice, ceea ce semnifica imuno-depresie, (Pier, 1981). In cazurile cele mai severe evolutia merge catre coma si moarte. Doza letala 50 (DL50) la suine este de 0,60mg/kg greutate corporala.

In cursul intoxicatiilor cronice, ficatul este organul cel mai afectat, fiind observate aceleasi semne clinice ca si in cazul unei toxicitati acute: vacuolizarea hepatocitelor, fibroza inter-lobulara, hiperplazia canalelor biliare, infiltratia periportala cu limfocite (Fernandez si col., 1994 ; Harvey si col., 1988; 1991; 1995) etc. Pe langa alterarile inregistrate la nivelul ficatului, pot fi observate alterari si la nivelul altor organe; animalele intoxicate prezinta congestia creierului, o degenerescenta cardiaca, o necroza a tubilor renali si infiltratii limfocitaire ale mucoasei intestinale (Pier si colab., 2000).

Studii in vivo cu AFB1 marcata radioactiv au demonstrat ca aceasta toxina se poate localiza la scroafe la nivelul mucoaselor nazale si respiratorii, iar studii in vitro cu preparate microzomale din diferite tesuturi au confirmat ca mucoasa nazala si respiratorie este predispusa la formarea de complexe intre metabolitii AFB1 si ADN (Larsson si Tjlve, 1996).

Efectul aflatoxinelor asupra performantelor de crestere

Efectele intoxicarii cu aflatoxine asupra performatelor de crestere la porc sunt cunoscute de multa vreme. De exemplu, Duthie si colaboratorii, (1966 ) au realizat la porci in faza de crestere (20-70 kg) o expunere prelunginta la trei doze de aflatoxina, 0,14, 0,28 si 0,41 mgAF/kg furaj si au constatat o diminuare a performatelor (spor si consum de hrana). In decursul anilor au fost realizate numeroase studii experimentale prin expunerea animalelor la doze diferite de toxina si la diferite forme de toxina administrata (pura, extracte sau cereale contaminate natural) care au aratat de asemenea, o diminuare a sporului in greutate si a consumului de hrana (Souhtern si colab., 1979; Ketterer si colab., 1982; Harvey si colab., 1989a, 1990, 1991; Meissonnier si colab., 2007, 2008).

Hepatotoxicitatea aflatoxinelor

Ficatul reprezinta organul tinta pentru actiunea toxica a aflatoxinei la porc. Unul dintre cele mai detaliate studii toxicologice despre efectul AF la nivel hepatic realizat la porc a fost cel condus de Harvey si colab. (1988) pe purcei intre 10-30 kg; autori au descris efectele a patru niveluri de expunere: 1, 2, 3 si 4 mg AF /kg furaj, timp de 28 de zile; dupa prima saptamana experimentala, tabloul clinic a fost decris ca normal pentru animalele expuse dozelor de 1 si 2 mg de AF, desi culoarea lobilor heaptici la animalele intoxicate cu 2 mg AF a fost modificata. Pentru cele expuse la 3 si 4 mg AF /kg furaj, autorii au raportat apartia asteniei si icterului, o lobare pronuntata si o culoare galben decolorata a lobilor hepatici. Cu cat doza de AF a fost mai mare cu atat activitatea enzimatica serica, marker al leziunilor hepatice, urmarita saptamanal, a aratat modificari precoce, traduse printr-o cresterea semnificativa a aspartat aminotransferazei (AST) si alkalin fosfatazei (ALK); cresterea gamma globulin transferazei (?-GT) a fost observata doar pentru dozele de 3 si 4 mgAF/kg furaj.

Efectele aflatoxinelor asupra sistemului cardio vascular

In prezent exista putine date despre efectul aflatoxinelor asupra dezvoltarii sistemului cardiovascular la porc. Un exemplu poate fi dat totusi in acest sens. Abdel Hang si colaboratorii sai, (2000) a investigat efectul specific AF asupra atriului la porci guinea si a observat ca Isoprenalina [ISO, (4x10-9M), AFB1, (3x10-6M si 6x10-5M)] si AFG1 (3x10-6M si 6x10-6M) a contractat atriul lasand preparatul hiperresponsiv la ISO. Aceste proprietati ale AF ar putea fi responsabile de anumite efecte cardiotoxice descrise in literatura pentru alte specii.

Efectele aflatoxinelor asupra sistemului reproducator

Aflatoxinele nu induc efecte importante asupra reproductiei (Robens si Richard, 1992). Cu toate acestea, investigatii privind efectele AF asupra sistemului reproducator la pasari, au aratat ca AF poate sa suprime spermatogeneza si sa atrofieze spermatozoizii partial sau total in functie de doza; in plus, degenerarea si descuamarea epiteliului asociata cu micsorarea stratului germinativ al tubilor seminiferi, precum si o scadere a testosteronului plasmatic au fost observate (Ortatatli si col., 2002). In prezent exista insa putine date despre efectul aflatoxinelor asupra dezvoltarii sistemului reproducator la porc. Studii efectuate pe celule spermatice de vier au aratat insa ca aflatoxina B1, M1, M3 si zearalenona au micsorat mobilitatea acstor celule la concetratii de (0.004 mg ml(-1), 0.1 mg ml(-1) and 10 mg ml(-1) (Rajkovic si colab., 2007) precum si alti parametri spermatogenetici (viabilitatea, concentratia, volumul spermei, procentul de spermatozoizi anormali, etc) (Picha si colab., 1986).

2. OCHRATOXINE

Ochratoxinele au o toxicitate mai mica decat aflatoxinele, iar Ochratoxina A (OTA) a fost clasificata in grupul 2B (probabil cancerigena) de catre IARC (1993). Comitetul Stiintific European pentru Alimentatie Umana (SCF, 1998), considerand caracterul cancerigen probabil al OTA, recomanda o reducere a expunerii alimentare la o valoare sub 5 ng/kg greutate corporala/zi.

Toxicitatea acuta

DL50 este de 30,3 mg/kg greutate corporala la sobolanii masculi, in timp ce pentru femele este de 21,4 mg/kg greutate corporala. Cainele si porcul sunt speciile cele mai sensibile, soarecele si sobolanul sunt cel mai putin sensibili (AFSSA, 2006). La porci, ingestia a 28 ppm ochratoxina a determinat moartea in decursul a 3 saptamani (Szczech si colab., 1973). Administrarea pe cale orala la porc a unor doze de 1 mg/kg corp a determinat anorexie, depresie, diaree, febra, polidipsie, poliurie, deshidratare si in final moartea (Harwing si Munro, 1975).

Efectele ochratoxinei asupra performantelor de crestere

Porcii cu greutate de 20-90kg care au fost hraniti cu o dieta contaminata cu OTA (0-2300pg/kg) au prezentat o stare de sanatate corespunzatoare in conditiile absentei patogenilor dar au prezentat o reducere a consumului de hrana, scadere in greutate, cresterea consumului de apa si poliurie (Krogh si colab., 1974). Concentratiile cuprinse intre 0-200pcg OTA/kg hrana au avut efecte scazute asupra sporului de greutate si conversiei hranei, in timp ce concentratii mai mari de 1400 pg/kg au fost prezente in hrana. Chiar dupa cateva saptamani de intoxicare cu OTA, perfomanta purceilor a revenit la normal cand hrana purceilor a fost inlocuita cu o dieta normala. De asemenea, Malagutti si colaboratorii., (2005), intr-un studiu realizat la porci la ingrasat, au aratat ca intoxicarea cu OTA (25?g/kg) timp de 119 zile a determinat o scadere a greutatii medii, in timp ce consumul specific nu a fost modificat.

Efectele ochratoxinei asupra sistemului reproducator

Dupa unele studii, ochratoxicoza nu a fost asociata cu probleme de reproductie (Shreeve si colab., 1977) la porci. Pe de alta parte, s-a demonstrat ca OTA poate afecta fertilitatea la vieri si poate fi teratogena, dar numai la concentratii mari (Fink-Gremmels, 1999). Biro si colab. (2003) au aratat ca administrarea pe cale orala la vieri a 20 mg OTA timp de 6 saptamani a determinat o scadere a viabilitatii, mobilitatii si motilitatii spermatozoizilor, in timp ce numarul si morfologia celulelor Leydig si structurile epididimale au ramas nemodificate. Toxina ajunge foarte repede dupa intoxicare in plasma seminala si induce o reducere a motilitatii si a longevitatii spermatozoizilor de vier (Solti si colab., 1999). Cand OTA traverseaza bariera placentara, acest fapt poate afecta cresterea fetala si poate determina chiar o necroza a cozii (Marquardt si Frohlich, 1992).

Toxicitate specifica: Nefrotoxicitate

Porcii care au consumat o dieta continand 200-4000 pg/kg OTA au dezvoltat o nefropatie dupa 4 luni la toate nivelurile de expunere. Leziunile au aparut la nivel renal, si majoritatea alterarilor renale au fost asociate cu distrugerea tubulilor proximali (Krogh si colab,1974).

Desi suinele sunt relativ sensibile la prezenta OTA in dieta, efectele toxice tind sa se manifeste mai mult ca alterari celulare si ale organelor decat ca semne clinice aparente. In studiile de toxicitate cronica, animalele expuse la o doza de 0,2 ppm dezvolta o nefropatie dupa citeva luni (Krogh si colab., 1974). Leziunile apar rapid in conditiile unei intoxicatii importante. La o doza de 1-4 ppm, umflarea si decolorarea rinichilor apar la doua saptamani dupa expunere (Elling si colab. 1985). La aceste concentratii pot aparea si alterari ale parametrilor bichimici sanguini si este initiata disfunctia renala (cresterea frecvetei urinarii si a aportului de apa). Reducerea consumului de hrana si descresterea greutatii corporale poate deveni evidenta la diete continand concentratii mai mari de 2 ppm OTA (Tapia si Seawright, 1985; Huff si colab., 1989).

3. DEOXINIVALENOL

Inca din anul 1920, in Statele Unite ale Americii si Germania era cunoscut faptul ca cerealele infestate cu Fusarium graminearum cauzeaza fenomene de refuz al ratiei alimentare si de voma la porci. Curtin si Tuite (1966) au provocat aceste simptome la porci prin administrarea experimentala a unui extract de porumb contaminat cu F. graminearum. In 1973, Vesonder izoleaza deoxinivalenolul (DON) din culturi pure de F. graminearum, iar cativa ani mai tarziu obtine aceleasi simptome la porci prin administrarea mucegaiului in cultura pura. Desi DON este considerat unul dintre trichotecenele care determina cel mai putin toxicitate acuta, (Rotter si colab., 1996), intoxicatia cu DON se manifesta prin refuzul alimentelor, greata, varsaturi si tulburari digestive (Conkova si colab., 2003; Sudakin si colab., 2003; Hussein si colab., 2001; D Mello si colab., 1999; Ehling si colab., 1997). Efectele toxice depind de specie, parametri individuali (sex, varsta, greutate corporala etc) precum si de timpul de expunere. Porcii sunt animalele de ferma cele mai sensibile la actiunea DON, o doza de 12?g DON/kg nutret provoaca refuzul alimentului, masculii fiind mai sensibili decat femelele.

Efectul deoxinivalenolului asupra performantelor de crestere

Numeroase studii au aratat ca prezenta DON-lui in furaje altereaza performantele animalelor de ferma (greutate, viteza de crestere si consum de hrana). Efectul negativ este cu atat mai important cu cat concentratia de DON in hrana este mai mare; dupa unele cercetari, acest efect se diminueaza dupa a doua saptamana daca concetratia de DON este mai mica de 4mg DON/kg (Friend si colab., 1982; Foster si colab., 1986; Bergsje si colab., 1992). Intr-o sinteza bibliografica Dersjant-Li si colab., (2003) afirma ca o scadere de 5% a vitezei de crestere are loc in prima saptamana de administrare a unui furaj natural contaminat continand 0,6 mg de DON/kg. O reducere a consumului poate avea loc si la concentratii sub 4 mg, dar efectul se manifesta doar in prima saptamana (Foster si colab., 1986). Relatia intre concentratia de DON si reducerea consumului este mult mai stransa in cazul porcilor tineri (R2=0,90) decat in cazul porcilor la ingrasat (R2=0,42).

Efectul deoxinivalenolului asupra reproductiei

Putine studii sunt consacrate efectelor DON asupra reproductiei. Se cunosc doar 5 studii efectuate pe scroafe primipare in perioada de gestatie propriu zisa, unul pana la a 52- a zi de gestatie (Friend si colab., 1983), altul intre a 91 a zi de gestatie si fatare (Diaz-Llano si Smith, 2006) si ultimile trei in timpul ciclului complet de gestatie-lactatie (Chavez si colab., 1984; Friend si colab., 1986b; Etienne si colab., 2006), studii in care nu a fost constatat niciun efect pina la 6,2 mg de DON/kg de furaj in afara unui consum de hrana scazut. Un efect similar se produce in timpul lactatiei, iar in laptele scroafelor au fost gasite doar urme de toxina (Friend si colab., 1986b; Etienne si colab., 2006). La porci (23 kg) care au consumat timp de 7 saptamani hrana continand aproximativ 4mg de DON/kg, examenul tubilor seminiferi la masculi sau foliculilor ovarieni la femele nu au relevat niciun efect asupra dezvoltarii lor sexuale (Friend si colab., 1986b). In afara unui studiu intreprins de Friend si colab., (1983) in care 3,5 ppm de DON tinde sa reduca greutatea si lungimea fetusului de 52 de zile, se pare ca hranirea scroafelor cu un furaj contaminat cu DON (5,7 ppm) nu a afectat efectivul si greutatea purceilor vii la nastere, supravietuirea lor si viteza lor de crestere pana la intarcare, dar creste numarul de purcei nascuti morti (Diaz-Ilano si Smith, 2006).

Efectul deoxinivalenolului asupra parametrilor hematologici si plasmatici

Efectele DON-lui asupra diferitilor parametri hematologici (elemente figurate, hematocrit, hemoglobina) sau asupra nivelurilor circulante de metaboliti, hormoni sau enzime hepatice sunt limitate. Harvey si colab., (1989b; 1996), Rotter si colab., (1994; 1995) si Accensi si colab., (2006) nu au constatat niciun efect asupra formulei sanguine la purcei intoxicati cu DON. Totusi, modificari episodice ale numarului de hematii, plachete si hematocrit (Prelusky si colab., 1994) si o crestere a numarului de leucocite au fost observate de Rotter si colab., (1994), la o rata de 3 mg DON/kg de furaj. Dupa Lun si colaboratorii., (1985) uremia si creatinina nu sunt afectate la concentratii de DON intre 0,28 si 19 ppm. Din contra o scadere a proteinelor, a alfa si beta-globulinei si albuminei serice au fost semnalate la doze de 3,5 ppm de DON la porci intre 21 si 101 kg (Bergsj si colab., 1993; Prelusky si colab., 1994; Rotter si colab., 1994). Dupa Rotter si colaboratorii, (1995) si Eriksen si Petterson (2004), aceste modificari ar putea fi legate de diminuarea sintezei proteice care reprezinta una din principalele alterari metabolice provocate de DON.

4. FUMONISINA

Toxicitatea fumonizinelor este provocata in primul rand de alterarea la nivel celular a metabolismului sfingolipidelor prin inhibarea ceramid sintazei, enzima cu rol cheie in biosinteza acestor complexe esentiale pentru mentinerea structurii membranelor celulare si ca situsuri de legare la nivelul membranelor. Toxicitatea specifica fiecarei specii este caracteristica toxicitatii fumonizinelor.

Toxicitatea acuta a fumonizinelor

La porcine, faza de toxicitate acuta a FB induce edem pulmonar (EP) (vezi paragraful 3.2.7.3). EP este indus de ingerarea zilnica a 4,5-6,3 mg FB/kg greutate corporala. In unele cazuri, majoritatea intalnite in USA, EP a fost insotit de hepatoxicitate (Motelin si colab., 1994; Marin si colab., 2006; Casteel si colab., 1993; Gumprecht si colab., 1998). Estimari ale riscului intoxicarii cu FB realizate de Comitetul Stiintific pentru Alimentatie (Scientific Committee on Food-SCF) au stabilit ca nivelul sau concentratia de FB la care nu a fost observat niciun efect (NOAEL) este pentru porci < 4,5 mg FB/kg corp; pentru o expunere de scurta durata, 4,5 mg FB/kg corp este nivelul la care se produce edemul pulmonar, (IARC, 2002).

Efectul fumonizinelor asupra performantelor de crestere

Numeroase studii au aratat ca FB1 are un efect minor sau nu are efect asupra greutatii corporale a porcilor, oricare ar fi forma de FB1 experimentata: toxina pura (cristalizata) (Harvey si colab., 1995), extract (Oswald si colab., 2003; Zomborszky-Kovcs si colab., 2000; Haschek si colab., 1992) sau porumb contaminat natural (Haschek si colab., 1992). Dar, unele studii au ajuns la concluzia ca porcii masculi sunt mai sensibili fiind mai grav afectati decat femelele (Casteel si colab., 1993; Rotter si colab., 1996).

Efectele fumonizinelor asupra sistemului cardio vascular

Datele despre toxicitatea cardiovasculara indusa de FB au fost inregistrate in cazuri de intoxicare cronica in care hrana contaminata cu material infestat cu F. verticilioides a dus la hipertrofia ventriculara dreapta a inimii si hipertrofia arterelor pulmonare la porci (Smith si colab., 1999, Constable si colab., 2003). Efectele negative ale FB asupra sistemului vascular apar inainte de aparitia edemului pulmonar (Harvey si colab., 1996) si sunt dependente de timpul de expunere. Hranirea timp de 210 zile cu o dieta contaminata cu 100 pana la 190 mg FB1/kg de hrana a declansat hipertensiune arteriala prin atrofia ventriculara stanga si hipertrofie mediala a arterelor pulmonare mici (Harvey si colab., 1996).

Efectele fumonizinelor asupra sistemului de reproductie

In prezent exista putine date pentru a sprijini concluzia conform careia consumul de FB are efect toxic asupra dezvoltarii si reproducerii animalelor de ferma. Cu toate acestea, o preocupare pentru efectele FB asupra dezvoltarii si reproducerii a aparut dupa observarea avorturilor la scroafele gestante hranite cu diete contaminate cu FB (Harrison si col, 1990). Intr-un studiu (Oswald si colab., 2003) se arata de exemplu, ca un material de cultura continand F. Vericilioides administrat la trei scroafe gestante a pus in pericol fetusii in uter. Intradevar, purceii sacrificati imediat dupa nastere prezentau edem pulmonar, patologie a ficatului, activitate crescuta a enzimelor serice (AST, GGT, AKLP) si nivel marit al raportului sfinganina (Sa)/sfingozina (So) in ser. Acest studiu a demonstrat de asemenea un transfer al FB1 in lapte. In schimb, intr-un alt studiu (Becker si colab., 1995) se arata ca nu s-a detectat FB1 in laptele scroafelor care au ingerat concentratii subletale de FB1 (100 mg/kg hrana) timp de 17 zile (Becker si colab., 1995). Un alt studiu mai recent al lui Gbore (2009) a revelat ca hrana contaminata cu FB (1) a intarziat maturarea sexuala la purceii in crestere si a sugerat ca expunerea la furaje contaminate cu concentratii mai mari de 5 mg FB1/kg ar trebui evitata pentru a obtine performante reproductive optime. Datele privind alte specii de animale (sobolan, iepure si bovine) au confirmat absenta transferului placental si nivel scazut in lapte (EC, 2003).

5. ZEARALENONA

Efectul toxic specific cel mai cunoscut produs de zearalenona (ZEA sau ZEN) este la nivelul sistemului reproducator. Aceasta toxicitatea depinde ca si in cazul aflatoxinei de interactiunea ei sau a metabolitilor ei cu receptorii estrogeni. Porcul este cea mai sensibila dintre speciile domestice la efectul zearalenei.

Toxicitatea acuta

Administrarea unei doze unice de pana la 3,5 mg/kg greutate corporala la scroafele tinere determina inflamatii si edeme vulvare, iar la doze mai mari de 25 mg/kg greutate corporala apar simptome de oestrogenism. Concentratiile mari de zearalenona (ZEA) induc la porci un oestru prelungit, un sindrom de pseudo-gestatie si infertilitate (Fink-Gremmels, 1999). 3.5.2. Efectul zearalenonei asupra sistemului reproducator si de dezvoltare Specia, considerata cea mai sensibila este porcul; intoxicatia cu ZEA se caracterizeaza prin fenomene de oestrogenism, edeme vaginale, atrofia ovarelor, hipertrofia glandelor mamare (Rainey, 1991).

• Efecte la scrofitele pubere
  Administrarea de ZEA in furaj, in doza de 0,02 mg/kg greutate corporala zilnic, timp de 8 zile, determina aparitia simptomelor caracteristice oestrogenismului; administrarea repetata de ZEA in furaj, in doza de 0,13 mg /kg furaj la scroafele pubere antreneaza aparitia sterilitatii, o pseudogestatie si persistenta oestrului (Etienne, 1994).
  Consumul a 2 kg hrana contaminata cu 0, 1, 5 sau 10 mg/kg ZEA in perioada cuprinsa intre zilele 5-20 ale oestrului de catre scrofitele mature non-gestante, a determinat o crestere a intervalului inter-oestrus de la 21.0 0.3 zile in control la 29.2 2.9 si 32.7 3.3 zile la scrofitele intoxicate cu 5 sau 10 mg ZEA /kg hrana. La scrofitele cu oestru prelungit, s-a observat o crestere a concentratiei progesteronului si mentinerea prelungita a corpului galben. Acesta regreseaza cand ZEA a fost inlaturata din dieta (Edwards si colab., 1987). Intr-un alt studiu care a utilizat un numar redus de femele, efectele estrogenice au fost raportate la concentratii mai scazute (Bauer si colab., 1987). Intoxicarea animalelor cu 0.25 mg/kg ZEA in dieta (echivalent a 10 g/kg greutate corp/zi) timp de 11 zile, urmat de 5 zile de hrana fara ZEA a determinat inrosirea vulvei, secretii ale mameloanelor si prezenta a numerosi foliculi veziculari si chistici in ovare. Ingestia de ZEA determina o crestere a progesteronului din ser si o descrestere a prolactinei si a concentratiei de hormon luteinizant; ea determina leziuni histologice minore in organele de reproducere si in glandele suprarenale si in tiroida (Prelusky si colab., 1993). Ingestia de ZEA la scrofite determina atrezia foliculara si modificari apoptotice in celulele granuloase (Obremski si colab., 2003). ZEA induce de asemenea o intensificare a proliferarii celulare la nivelul uterului si oviductului.
• Efecte la purceii tineri
  Administrarea de ZEA la purcei tineri provoaca feminizare (atrofia testiculelor si dezvoltarea glandelor mamare) (Coulombe, 1993). Administrarea a 2 ppm ZEA la purceii in varsta de 21 zile determina efecte de oestrogenism la nivel testicular, uterin si ovarian (Yang, 1995).
• Efecte la scroafele mature
  La scroafele mature ZEA inhiba ovulatia si reduce talia descendentilor. Semnele clinice apar la animale hranite cu furaj mucegait continand 12-14 mg ZEA/kg greutate corporala, desi efecte toxice determinate de ZEA au fost observate si in cazul contaminarii cu doze mai mici de 1 ppm (Coulombe, 1993). Mai multi autori au demonstrat ca administrarea de furaj contaminat cu 1-3 ppm ZEA provoaca disfunctii la nivelul reproductiei; cu toate acestea Yang (1995) demonstreaza experimental ca administrarea a 2 ppm ZEA in a 30-a zi de gestatie la scroafe nu altereaza functia de reproductie. ZEA si metabolitii determina reducerea numarului progeniturilor, performante scazute post-intarcare, agalactie si o posibila crestere a mortalitatii fetale, desi exista rezultate contradictorii privind acest efect (Prelusky si colab., 1993).
• Efecte la vieri
  ZEA in concentratii (3 - 9 ppm) administrata la vieri la varsta de 32 de zile, nu a afectat libidoul, dar a determinat o scadere a volumului de sperma si a motilitatii spermatozoizilor (Young si King, 1986). ?-Zol si ZEA, la concentratii picomolare, influenteaza negativ structura cromatinei si viabilitatea spermatozoizilor, in timp ce ?-ZOL influenteaza negativ motilitatea spermatozoizilor la concentratii micromolare (Benzoni si colab., 2008). Alte studii (Tsakmakidis si colab., 2008) au aratat ca ZEA si ?-Zol nu afecteaza motilitatea spermatozoizilor de vier, in timp ce ZEA si ?-Zol, independent de doza a determinat instabilitatea cromatinei (P < 0.05) la spermatozoizilor de vier. Prin efectul lor toxic, ZEA si metabolitii pot afecta calitatea spermei in vitro si in consecinta, descresc capacitatea de fertilizare a spermei (Tsakmakidis si colab., 2006). Astfel, spermatozoizii de vier expusi timp de 1h la concentratii diferite de ZEA si ?-Zol (40, 60 si 80 ?g/ml) au avut o capacitate redusa de legare a zonei pelucida (Tsakmakidis si colab., 2007).

Teratogenitatea zearalenonei

La porc, administrarea de furaj contaminat cu ZEA in doza mai mare de 20 mg/kg pune in evidenta efectul teratogen al ZEA prin modificari ale dezvoltarii membrelor (Diekman si Green, 1992). Prezenta ZEA (3.12 micromol/L) in cursul maturarii oocitelor de porc reduce procentul de oocite care se divid si formeaza un blastocist (12%), comparativ cu 25% la oocitele control (Malekinejad si colab., 2007). De asemenea, ZEA a determinat o cresterea procentului de blastomeri aneuploizi, la embrionii proveniti de la oocitele expuse la micotoxina.

2. Detoxificarea biologica in contextul asigurarii securitatii si sigurantei alimentare

Definitia detoxificarii biologice

Metodele pentru detoxificarea produselor agricole contaminate cu micotoxine pot fi impartite in metode fizice, chimice si biologice. Metodele biologice au fost adesea ignorate (Riley si colab., 1993) sau cu cateva exceptii (Bhatnagar si colab., 1991) au fost tratate doar sumar in articole de sinteza privitoare la decontaminarea micotoxinelor (Mueller, 1981; Doyle si colab., 1982; Scott, 1991; Park, 1993). Aceasta reflecta faptul ca in trecut au fost realizate un numar redus de studii referitoare la detoxificarea micotoxinelor prin metode biologice comparativ cu metodele chimice sau fizice.

Progresele facute in domeniul biotehnologiei in ultimii ani, cat si faptul ca populatiile microbiene pot avea capacitati catabolitice nelimitate va determina probabil in viitorul nu foarte indepartat o modificare a acestei tendite in favoarea metodelor biologice. Spre deosebire de metodele fizice si chimice, detoxificarea biologica este inca insuficient definita. Astfel aditivii furajeri care leaga micotoxinele, aditivii care imbunatatesc gustul, si alte interventii nutritionale au fost grupate in cadrul metodelor biologice de decontaminare (Charmley si Prelusky, 1994). Chiar amestecarea cerealelor contaminate cu cereale de buna calitate pentru a reduce concentratia de micotoxine la nivele acceptabile este considerata a fi o metoda biologica (Charmley si Prelusky, 1994; Charmley si colab., 1995). Dilutia cerealelor contaminate cu aflatoxine cu cereale, denumita decontaminare biologica criminala, a fost folosita pe scara larga in trecut (Patterson si Young, 1993). In prezent, aceasta practica este interzisa de Comunitatea Europeana incepand cu 1 ianuarie 1999 (Directiva Comisiei Europene 1525/98). In conformitate cu Bhatnagar (1991), detoxificarea biologica este definita ca degradare enzimatica sau transformare a toxinelor care conduce la aparitia unor produsi mai putin toxici. Aceasta clasificare include micotoxinele si ficotoxinele. Acest capitol prezinta microorganismele ca sursa de enzime si gene de detoxificare, fiind tratate doar aspectele legate de detoxificarea realizata de microorganismele rezidente in tractul digestiv, mediu, etc. Transformarea metabolica a micotoxinelor de catre enzimele provenite din tesuturile animale nu are aplicabilitate practica.

Degradarea biologica a micotoxinelor in plante poate fi observata in camp si in cursul depozitarii dupa recoltare. Desi au fost facute mari progrese in identificarea microorganismelor, enzimelor si genelor responsabile pentru detoxificare, complexitatea sistemelor responsabile de degradare face ca interpretarea observatiilor sa fie dificila si impiedica elucidarea mecanismelor care stau la baza acestora. Cu toate acestea, rezultatele obtinute pot fi utilizate pentru dezvoltarea unor proceduri de inactivare a micotoxinelor in conditiile complexe ale sistemelor agricole, productiei vegetale si animale.

Detoxificarea micotoxinelor de catre bacterii capabile sa produca fermentatie

Bacteriile acido-lactice (LAB) pot fi intalnite in mod normal in hrana sau sunt adaugate ca si culturi pure la diferite produse alimentare. Ele sunt considerate ca neavand efecte negative si chiar sunt implicate in ameliorarea sanatatii umane si animale (probiotice). LAB au un statut GRAS (considerat a fi sigur) si se estimeaza ca 25% din dieta europeana si 60% din dieta din multe tari in curs de dezvoltare constau din alimente fermentate (Stiles, 1996). LAB sunt bine cunoscute ca si culturi starter in fabricarea produselor lactate cum ar fi iaurtul, untul, branza (Carr si colab., 2002). Coexistenta LAB si a fungilor este de asemenea essentiala pentru sucesul unor aplicatii biotehnologice, ex. aluatul dospit unde raportul LAB/drojdii este de 100:1 (Gobbetti, 1998). Traditia de a utiliza LAB in hrana combinata cu cunostiintele recente asupra efectului pozitiv asupra sanatatii determinate de ingestia de LAB, au sugerat ca ele reprezinta o sursa alternativa la conservantii chimici. Studii recente au aratat ca LAB pot fi implicate si in dimunarea concentratiei de micotoxine.

Ideea de a decontamina cerealele prin fermentare a fost initiata la inceputul 1980. Insilozarea este o tehnica traditionala pentru conservarea furajelor prin fermentare acido-lactica. Fungii din materialul insilozat pot produce micotoxine in conditii aerobe. Oricum, micotoxinele pot fi deasemenea degradate in cursul insilozarii.

Se pare ca diminuarea concentratiei de micotoxine provine din scaderea nutrientilor, determinand o reducere a sintezei de micotoxine sub cea a degradarii non-enzimatice. Mai mult, ei au emis ipoteza ca degradarea enzimatica realizata de organismele producatoare in conditii de infometare poate deasemenea contribui la degradare. In ultima perioada s-a realizat un numar mare de studii care au investigat rolul bacteriilor acido-lactice (LAB) in reducerea concentratiei de micotoxine.

Aflatoxine

Aflatoxina B1 a fost detoxificata in aflatoxina B2a in decursul fermentatiei iaurtului (Megalla si Hafez, 1982), desi nu se stie sigur daca a fost rezultatul transformarii enzimatice sau o conversie spontana in conditii de aciditate.

Aflatoxina B1 a fost detoxificata in cursul fermentarii laptelui de catre bacteriile acido-lactice (Megalla si Mohran, 1984) si al fermentarii painii in procesul de productie (El-Banna si Scott, 1983). Pierderi semnificative ale aflatoxinei B1 au fost observate si in decursul procesului de fabricare al berii (Chu si colab., 1975). Legarea in vitro a aflatoxinelor de catre bacteriile viabile si omorate prin caldura sunt prezentate in tabelele 1 si 2.

Mokoena si colab. (2006) au observant ca in urma procesului de fermentare al porumbului are loc o scadere semnificativa a concentratiei de AFB1 (75% in a 4-a zi, din concentratia initiala de 60?g/g). Testele de citotoxicitate realizate cu extractele de fermentatie au aratat ca cele provenite din porumbul inoculat cu culturi starter au fost mai putin toxice (3036%) decat cele la care nu s-a adaugat o cultura starter (24 30%).

Oluwafemi si colab. (2010) au observant ca inocularea porumbului contaminat cu aflatoxina B1, cu tulpini de Lactobacillus acidophilus, L. brevis, L. casei, L. delbruekii si L. plantarum a determinat dupa 5 zile o reducere a contaminarii cu AFB1 cuprinsa intre 29.9% si 44.5% . L. plantarum a fost cea mai eficienta tulpina in degradarea AFB1. Intr-un experiment in care a fost evaluata capacitatea unor bacterii probiotice de a lega aflatoxinele G1, G2 si B2, L. acidophilus CU028 si L. brevis CU06 au legat aproximativ 50% din AFG1 (Byun si colab., 2005), L. acidophilus CU028 a legat aproximativ 67% din AFG2, iar L. acidophilus CU028 si L. helveticus CU 631 au fost cele mai eficiente tulpini in legarea AFB2 intre 38,0% pana la 55,9%. Deasemenea, Chelule si colab, au aratat ca fermentatia lactica a porumbului si a amahewu (mancare traditionala pe baza de porumb) a determinat o reducere a concentratiei de micotoxine (AFB1, FB1 si ZEA) pana la 100% si respectiv 33,5%

Hernandez-Mendoza si colab., (2009) au analizat capacitatea a opt tulpini de Lactobacillus casei isolate din diferite nise ecologice de fermentatie (branza, porumb, fecale, bauturi) de a lega aflatoxina. Tulpinile au prezentat capacitati diferite de a lega aflatoxina; tulpina cu cea mai mare capacitate de legare a AFB1 a fost L. casei L30, care a legat 49.2% din aflatoxina disponibila (4.6 lg/mL). In general, izolatele umane leaga cea mai mare parte din aflatoxina B1 si izolatele de branza cea mai putina. Stabilitatea complexului bacterieaflatoxina a fost determinata prin spalari repetate. Legarea a fost reversibila, cu o eliberare a AFB1 din complexe cuprinsda intre 0,6 si 9,2%.

Unele tulpini de bacterii acido-lactice au fost capabile sa lege aflatoxina B1 in vitro si in vivo (Kankaanp si colab., 2000; Gratz si colab., 2004), cu o eficienta care depinde de tulpina bacteriana (Shah si Wu, 1999). El-Nezami si col. (1998) au evaluat abilitatea a 5 tulpini de Lactobacillus de a lega aflatoxine in vitro si a aratat ca tulpinile probiotice, cum ar fi Lb. rhamnosus GG si Lb. rhamnosus LC-705 au fost foarte eficiente in inlaturarea aflatoxinei B1, cu mai mult de 80% din toxina legata intr-o solutie de 20 ?g/ml solutie (Haskard si colab., 1998). Se considera ca aflatoxinele B2, G1 si G2 sunt mai putin sensibile la acest proces de legare (El-Nezami si colab., 2002b). Legarea in vitro a aflatoxinei B1 de catre bacteriile lactice a fost descrisa ca fiind un proces rapid si reversibil (Bueno si colab., 2006), dependent de tulpina si de doza (Kankaanp si colab., 2000).

In afara lactobacililor si alte LAB sunt implicate in detoxifierea aflatoxinelor. Astfel, Petchkongkaew si colab., (2008) au studiat interactia intre Bacillus spp.si o tulpina de Aspergillus flavus izolata din soia tailandeza fermentata in scopul limitarii sintezei de aflatoxina. O tulpina de Bacillus din cele 23 de izolate a fost capabila sa inhibe cresterea tulpinilor de Aspergillus si sa inlature AFB1 in procent de 74% si a fost identificata prin secventiere ITS ca fiind Bacillus licheniformis. O alta tulpina de Bacillus care a inhibat cresterea tulpinii de Aspergillus si a detoxificat 85% din cantitatea de AFB1 a fost identificata ca fiind B. subtilis. Scaderea concentratiei de AFB1 nu a fost corelata cu aparitia unui produs de degradare.

Topcu si colab (2010) au investigat capacitatea unor tulpini de Enterococcus faecium M74 si E. faecium EF031 de a detoxifica aflatoxina. Ambele tulpini, M74 si EF031 au avut capacitatea de a inlatura aflatoxina B1. In timp ce M74 inlatura 19,3 pana la 30,5% din aflatoxina B1, EF031 inlatura 23,4 pana la 37,5% din aflatoxina B1 in cursul unei perioade de incubare de 48 h. Inlaturarea aflatoxinei B1 a fost maxima la pH 7.0. Complexele formate intre aflatoxina B1 si tulpinile bacteriene au o stabilitate foarte mare, iar viabilitatea bacteriilor nu a fost importanta pentru detoxificarea aflatoxinei B1.

Pentru a clarifica modul de indepartare al aflatoxinei B1 de catre bacteriile lactice, a fost propus un model matematic (Bueno et al., 2006). Acest model sugereaza atasarea moleculelor de aflatoxina B1 la suprafata organismului si ia in considerare doua procese: legarea (adsorptia) si eliberarea (desorptia) aflatoxinei de si de la situsurile de legare de pe suprafata microorganismelor (Bueno si col., 2006; Lee si col., 2003). Utilizand acest model, s-a demonstrat ca capacitatea diferita a tulpinilor de a lega aflatoxina B1 este direct dependenta de situsurile de legare prezentate de fiecare microorganism. Se considera ca peptiodogicanul din peretele bacterian si polizaharidele sunt cele mai importante elemente responsabile pentru legarea LAC (Peltonen si colab., 2000 ; Haskard si colab., 2000 ; Bolognani si colab.,2000). In mod similar, El-Nezami si colab., (1998) au observat ca toate bacteriile gram-pozitive testate au fost mai eficiente in legarea AFB1 decat Escherichia coli, sugerand ca abilitatea bacteriilor sa inlature AFB1 este dependenta de structura peretelui bacterian.

Oatley si colab., (2000) au sugerat ca suprafata hidrofoba ar fi implicata in legarea aflatoxinei. Ei au raportat ca cea mai eficienta tulpina care leaga AFM1, Bifidobacterium bifidum BGN4 are o mare suprafata hidrofoba comparative cu alte tulpini. In plus, Peltonen si colab., (2000) au constatat ca diferentele in legarea AFB1 se datoreaza structurii diferite a peretelui bacterian. Se pare ca numeroase componente sunt implicate in legarea AFB1 (Peltonen si colab., 2001). Haskard, si colab.,(2000) a observat ca ordinea de legare a aflatoxinelor (AFB1 > AFB2 > AFG1 > AFG2), se coreleaza cu o descrestere a polaritatii compusilor si este corelata cu interactiile hidrofobe care joaca un rol in acest mechanism.

In mod similar, Pierides si colab. (2000) au aratat ca AFM1 a fost mai putin indepartata decat AFB1. Autorii considera ca acest proces e datorat grupului -OH pe care il poseda AFM1, care determina o crestere a polaritatii acestei molecule. Inlaturarea AFM1 din tamponul fosfat-salin de bacteriile viabile de Lactobacillus a avut loc intr-o proportie cuprinsa intre 18.1% si 53.8% in decurs de 15 16 h. Kabak si Var (2004) au constata ca abilitatea tulpinilor de a lega AFM1 a fost cuprinsa intre 25,7% - 32,5% si 21,2% - 29,3% in tamponul fosfat salin si respectiv in zer. Printre organismele studiate Bifidobacterium bifidum Bb13 a demonstrat o capacitate de legare mai mare a AFM1 (32.5%) in tampon fosfat salin fata de alte tulpini.

Ochratoxina

Piotrowska si Zakowska (2005) au analizat 29 de tulpini de bacterii acido-lactice apatinand genurilor Lactobacillus si Lactococcus, pentru capacitatea lor de a indeparata ochratoxina A din mediul lichid. Toate tulpinile testate au fost capabile sa reduca concentratia ochratoxinei A si multe dintre ele au fost insensibile la toxina. Cea mai mare adsorptie, (peste 50% ) a continutului initial de ochratoxina A, a fost obtinuta cu Lb. acidophilus CH-5, Lb. rhamnosus GG, Lb. plantarum BS, Lb. brevis si Lb. sanfranciscensis.

Rezultate similare au fost raportate de abilitatea LAB din vin de a lega ochratoxina A. Tulpinile de Lactobacillus species si Oenococcus oeni, obtinute din vin sau must, au fost capabile sa indeparteze OTA din mediul de cultura (Mateo si col., 2009). Tulpina de O. oeni a fost cea mai eficienta in reducerea concentratiei de OTA. Reducerea OTA a variat intre 18.81% si 59.71% in mediul contaminat cu 5 ng/ml, si intre 13.94% si 58.27% in mediul contaminat cu 2 ng/ml. Cantitatea de ochratoxina A inlaturata in cursul cresterii bacteriene variaza intre 8% si 28% si nici un produs de degradare nu a fost detectat, sugerand ca inlaturarea ochratoxinei A de catre LAB din vin a fost un proces de legare (Del Prete si colab., 2007).

Se pare insa ca legarea nu este singurul ,mecanism de indepartare al ochratoxinei, alter studii sugereaza ca scderea concentratiei de toxina in cursul fermentatiei ar fi datorat unei degradari enzimatice. Astfel, cantitatea de ochratoxina A in orz a scazut semnificativ in cursul insilozarii (Rotter si colab., 1990). Aceasta scadere a concentratiei de toxine s-a produs in orzul contaminat cat si intr-un amestec de orz insamantat cu un miceliu de Aspergillus ochraceus. Ochratoxina A din orz a fost deasemenea degradata in decursul procesului de fermentatie al berii (Krogh si colab., 1974; Chu si colab 1975). Identificarea unor produsi de degradare ai ochratoxinei (Nip et al., 1975) indica ca peptidazele au fost responsabile de degradarea ochratoxinei in cursul procesului de fabricare al berii.

Intr-un studiu de testare a capacitatii microorganismelor de degrada ochratoxina-A, Cheng-An Hwang si Draughon (1994) au izolat o tulpina de Acinetobacter calcoaceticus a fost capabila sa degradeze ochratoxina-A, intr-un mediu sarac care contine etanol, intr-un compus mai putin toxic numit alpha-ochratoxina.

Petchkongkaew si colab., (2008) au studiat interactia intre Bacillus spp.si o tulpina de Aspergillus flavus izolata din soia tailandeza fermentata in scopul limitarii sintezei de ochratoxina. O tulpina de Bacillus din cele 23 de izolate a fost capabila sa inlature OTA in procent de 92,5%. Scaderea concentratiei de OTA a fost datorata degradarii in metaboliti (Ota).

Fumonizinele

Alte studii au aratat ca LAB sunt capabile sa lege fumonizinele B1 si B2 (FB1, FB2) in tractusul gastrointestinal putand astfel contribui la decresterea biodisponibilitatii efectelor toxice asupra animalelor de ferma si oamenilor. Niderkorn et al. (2006) au fost primii care au examinat interactiile in vitro intre LAB si fumonisine. Ei au evaluat abilitatea a 29 de tulpini de LAB si a trei tulpini de Propionibacterium de a inlatura fumonisina B1 si B2 din mediul MRS acidifiat (pH 4.0). Niderkorn si colab. (2006) a demonstrat ca fumonisina B1 nu a fost inlaturata in aceeasi masura ca fumonisina B2. Majoritatea tulpinilor au fost capabile sa inlature ambele toxine, dar au fost observate diferente considerabile intre aceste tulpini. Tulpinile de Propionibacterium au fost mai putin eficiente in legarea toxinei decat LAB. Eficienta legarii a fost afectata de pH, intrucat pana la pH7, LAB au fost incapabile sa lege fumonisinele B1 si B2 (Niderkorn et al., 2006).

Mokoena si colab., (2005) au testat efectul fermentatiei asupra porumbului contaminat cu fumonisina B1 si zearalenona. Dupa 4 zile, citotoxicitatea potentiala a extractelor fermentate a fost investigata utilizand o linie de carcinoma de esofag uman si s-a observat o descrestere semnificativa de 67% si respective 75%. Autorii afirma ca fermentatia produsa de bacteriile acido-lactice poate reduce semnificativ concentratia de micotoxine in porumb.

Alti autori considera ca fumonisinele sunt neafectate de procesele de fermentatie si procesare enzimatica a alimentelor. Astfel Bothast si colab., (1992) a constatat ca fumonizina B1 rezista procesului de fermentare al porumbului.

Trichotecenele

El-Nezami si colab., (2002c) au investigat capacitatea bacteriilor Lb. rhamnosus GG, Lb. rhamnosus LC-705 si Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS de a lega sapte trichotecene: deoxinivalenol (DON), 3-acetildeoxinivalenol (3-AcDON), nivalenol (NIV), fusarenon (FX), diacetoxiscirpenol (DAS), toxina T-2 (T-2) si toxina HT-2 (TH-2). Autorii au demonstrat ca eficienta bacteriilor acido-lactice sa inlature trichotecenele (20 ?g/ml) variaza in functie de tulpina bacteriana si de toxina. De fapt, formele viabile sau omorate prin caldura de Lb. rhamnosus GG au avut o eficienta mai crescuta fata de Lb. rhamnosus LC-705. Cea mai eficienta tulpina a fost capabila sa lege patru din cele sapte toxine testate. Procentul de toxine legate a variat intre 18% si 93% (El-Nezami si colab., 2002c). Niciuna din tulpinile testate nu a fost capabila sa lege 3-AcDON. Mai mult, toxina HT-2 a fost legata doar de celulele non-viabile de Lb. rhamnosus GG si LC-705.

Cheng si colab. (2010), au ales din 59 de tulpini probiotice, doua tulpini de Bacillus care poseda capacitatea de a detoxifica DON. Capacitatea de detoxificare a atins nivelul maxim cand supernatantul de cultura al acestor bacterii a fost incubat la 370C, 180 rpm timp de 12 h, rata de detoxificare fiind de 98% si respectiv 71.4%. Aceasta rata scade odata cu cresterea temperaturii si potentialul de detoxificare este nul la o temperatura de 1000C. Autorii afirma ca mecanismul de detoxificare al DON este legat de unele substante termosenzitive din supernatantul acestor bacili.

Diferite tulpini de bacterii acido- lactice (LAB) sunt capabile sa lege DON, dar modul de actiune, nu pare a fi biodegradarea, intrucat nu a fost observata prezenta niciunui derivat al toxinei, iar indepartarea nu a fost afectata la bacteriile nonviabile. Capacitatea de legare a tulpinilor selectate poate fi utilizata pentru a descreste biodisponibilitatea toxinelor in furajele contaminate (Niderkorn si colab. 2006).

Pe de alta parte, DON nu a fost modificat in cursul procesului de fermentatie si cantitatea originala a fost regasita in bere (Scott si colab., 1992; Schwarz si colab., 1995).

Zearalenona

Metoda de utilizarea porumbului contaminat cu zearalenona pentru a produce etanol prin fermentare a fost descrisa de Bennet si colab. (1981). Desi etanolul produs a fost liber de micotoxine, reziduurile solide si solubile (componentii solubili in apa din lichidul de fermentatie) care sunt utilizate in hrana animalelor erau contaminate cu micotoxine. Din punctul de vedere al imposibilitatii utilizarii produselor de fermentatie ca hrana, experimentul nu a fost de success cu exceptia reducerii pierderilor financiare prin vanzarea etanolului.

Intr-un experiment care a testat capacitatea propionibacteriilor de a inhiba dezvoltarea fungilor si de a diminua concentratia de micotoxine din mediu, Gwizdowska si colab. (2008) au aratat ca atat bacteriile vii cat si cele moarte de Propionibacterium freudenreichi ssp freudenreichi a determinat o scadere a concentratiei de zearalenona din mediul lichid.

Abilitatea tulpinilor de Lb. rhamnosus GG si Lb. rhamnosus LC-705 de a inlatura zearalenona si derivatii sai ??-zearalenol) dintr-un mediu lichid a fost investigata de El-Nezami si colab. (2002a). Sedimentul bacterian a legat o proportie semnificativa a ambelor toxine (38% si 46%). Bacteriile tratate termic sau cu acid au fost capabile sa inlature zearalenona si ?-zearalenol, sugerand ca aceasta legare si nu metabolismul, a fost mecanismul prin care toxinele au fost inlaturate din mediu. Procesul a fost rapid si a depins de concentratia de bacterii si de toxine.

Coincubarea zearalenonei si ?-zearalenolului descreste semnificativ procentul toxinelor legate, indicand ca ambele toxine pot avea acelasi situs de legare pe suprafata bacteriana.

Alte micotoxine

Dacero si colab. (1997) au observat o descrestere graduala a concentratiei de alternariol si acid tenuazoic, produse de Arternaria spp., in cursul insilozarii semintelor de floarea soarelui. In conditii aerobe, acidul micofenolic, patulina, acidul penicilic si toxina PR, produse de Penicillium roqueforti inoculat artificial in siloz, atinge un maxim si apoi descreste in mod continuu (Muller si Amend, 1997).

Patulina este o micotoxina prezenta in sucul de mar obtinut din fructe infectate cu Penicillium expansum. Se considera ca fermentatia alcoolica a sucului de mere este implicata in reducerea continutului de patulina (Harwig si colab., 1973; Burroughs, 1977; Stinson si colab., 1978). Cea mai mare parte a patulinei este convertita in cursul fermentarii in produse solubile in apa, non-volatile, o singura fractie fiind metabolizata la CO2 (Stinson si colab., 1979). Produsul majoritar este probabil ascladiol (Moss, 1998). Faptul ca cidrul comercializat este contaminat cu patulina (Jelinek si colab, 1989) poate fi explicat prin diferentele in eficienta degradarii patulinei utilizand diferite metode de fermentare.

Topcu si colab (2010) au investigat capacitatea unor tulpini de Enterococcus faecium M74 si E. faecium EF031 de a detoxifica patulina. Ambele tulpini, M74 si EF031 au avut capacitatea de a inlatura patulina. In timp ce M74 inlatura 15.8 pana la 41.6% din patulina, EF031 a inlaturat 19.5 pana la 45.3% din toxina in cursul unei perioade de incubare de 48 h. Inlaturarea patulinei a fost maxima la pH 7,4. Complexele formate intre patulina si tulpinile bacteriene au avut o stabilitate foarte mare, iar viabilitatea bacteriilor nu a fost importanta pentru detoxificarea patulinei.

Mecanismul de legare a micotoxinelor de catre bacteriile acido-lactice

Putine investigatii au fost realizate in scopul de a elucida mecanismul prin care unele micotoxine sunt blocate de sedimentul de bacterii acido-lactice. A fost demonstrat ca atunci cand tratamentul termic sau acid au fost aplicate bacteriilor, abilitatea lor de a inlatura aflatoxina B1 a crescut (El-Nezami et al., 1998). In conformitate cu aceste rezultate, suplimentarea cu NaOH, Na2CO3 si isopropanol inflenteaza negativ aceasta legare. Viabilitatea tulpinilor de LAB nu a fost esentiala, sugerand ca legarea are loc probabil la nivelul peretelui celular. Acesibilitatea aflatoxinei B1 legata la anticorpii monoclonali a confirmat natura de suprafata a legarii (Haskard et al., 2001). S-a sugerat ca carbohidratii si/sau componentele proteice ale LAB joaca un rol major in legarea aflatoxinei intrucat tratamentul cu pronaza E si periodat (periodatul determina oxidarea grupului cis OH de grupurile aldehidice si carbonice) a determinat o reducere considerabila a capacitatii de legare a aflatoxinei B1 de catre bacteriile acido-lactice (Haskard si colab., 2000).

Se considera ca in aceasta interactiune nu sunt implicati acizi grasi, intrucat tratamentul tulpinilor de LAB cu lipaze nu a dus la o descrestere semnificativa a legarii aflatoxinei B1. Studiul realizat de Lahtinen si colab. (2004) a coroborat datele precedente si au condus la concluzia ca peptidoglicanul din peretele celular este responsanbil de inlaturarea aflatoxin B1 de catre tulpinile LAB. Privitor la interactiile chimice implicate in acest proces, se pare ca legaturile hidrofobe sunt cele mai plauzibile intrucat inlaturarea aflatoxinei B1 a fost semnificativ redusa cand LAB distruse prin tratament termic sau acid au fost tratate cu uree, ca agent anti-hidrophob. Tratamentele termice si acide sunt responsabile pentru denaturarea proteica, conducand la expunerea mai multor suprafete hidrofobe. Mai mult, cand celulele au fost tratate cu solventi organici, toxina legata a fost rapid extrasa, confirmand un rol potential al interactiilor hidrofobe in legarae aflatoxinei B1. (Haskard si colab., 2000). Haskard si colab. (2000) au raportat ca legaturile de hidrogen si interactiile electrostatice nu au fost implicate in legarea aflatoxinei B1 de LAB, intrucat acest proces nu a fost semnificativ afectat de ionii mono- si divalenti sau de variatiile pH-ului (2,5 8,5).

Pe baza interactiilor implicate in legarea zearalenonei si a-zearalenolului de LAB, se pare ca proteinele si carbohidratii sunt componentele bacteriene implicate in process (El-Nezami et al., 2004). Tratamentul enzimatic al bacteriilor viabile cu pronaza E nu a scazut capacitatea bacteriilor acido-lactice de a lega zearalenona si derivatii sai. Oricum, efectul aceleiasi enzime asupra LAB omorate prin tratament temic sau acid a afectat semnificativ capacitatea de legare, sugerand ca noile situsuri de legare expuse dupa un tratament termic sau acid au fost proteine. Lipaza nu a afectat aceasta interactive, in timp ce urea a scazut-o.

In ceea ce priveste mecanismul de actiune implicat in inlaturarea fumonisinelor de LAB, Niderkorn (2007) sugereaza ca peptidoglicanii reprezinta cele mai plauzibile situsuri de legare pentru fumonisine. Abilitatea LAB de legare a fost crescuta dupa ce bacteriile au fost omorate utilizand diferite tratamente fizice si chimice, in timp ce lizozimul si mutanolisinul care degardeaza peptidoglicanii inhiba partial aceasta capacitate. S-a raportat de asemenea ca lanturile de acid tricarbalic din moleculele de fumonzina joaca un rol important in procesul de legare intrucat fumonisina hidrolizata are o afinitate mai mica pentru LAB, si inactivarea grupului aminic nu are efect asupra procesului de legare (Niderkorn, 2007). Acelasi articol a incercat sa explice afinitatea scazuta a fumonisinei B1 utilizand un model. De fapt, un grup aditional hidroxil din fumonisina B1 poate forma o legatura de hidrogen cu un lant tricarbalilic, rezultand o configuratie spatiala in care lantul tricarbalilic este mai putin disponibil pentru a interactiona cu peptidoglicanii bacterieni. Indepartarea fumonizinei realizata de LAB a fost atribuita mai degraba aderarii la peretele bacterian decat legarii covalente sau metabolismului, intrucat moartea celulara pastreaza intacta capacitatea lor de legare. Peptidoglicanii pot juca un rol in procesul de legare. Astfel, elucidarea diferentelor dintre peretii bacterieni ai LAB poate face posibila selectarea speciilor de LAB cu capacitatea de a actiona ca agenti de conservare capabili sa reduca expunerea la fumonisinele care se gasesc in hrana umana si animala.

Stabilitatea complexului complexului dintre bacteriile acido-lactice si micotoxine

Potentialele apilicatii ale LAB de a reduce disponibilitatea micotoxinelor este legata de stabilitatea complexelor care se formeaza. In cazul unor interactii slabe, micotoxinele pot fi liberate prin spalarea continua a suprafetei bacteriene in tractusul gastro-intestinal. Cateva studii au incercat sa determine stabilitatea complexelor formate intre micotoxine si LAB si au dus la concluzia ca taria legaturii depinde semnificativ de conditiile de mediu. Astfel, dintr-un numar mare de tulpini de LAB izolate din aluat dospit si produse lactate, Lb. casei se considera a fi cea mai importanta bacterie capabila sa lege aflatoxina comparativ cu tulpinile de Lb. plantarum si fermentum (Fazeli si colab., 2009). Un studiu similar a fost realizat in ceea ce priveste abilitatea bacteriilor lactice si propionice de a lega fumonizinele (Niderkorn si colab., 2006). In concordanta cu alti autori puterea interactiei dintre micotoxine si LAB a fost influentata de structura peptidoglicanului si in special de compozitia in aminoacizi (Niderkorn si colab., 2009).

Bacteriile non-viabile conserva nealterata capacitatea de legare, iar supravietuirea bacteriilor viabile este redusa semnificativ de pH-ul scazut din stomac. Mai mult, unele tulpini de LAB care prezinta o aderare considerabila la celulele intestinale isi pierd aceasta proprietate cand leaga micotoxine cum ar fi aflatoxina B1 (Gratz si colab., 2004; Kankaanp si colab., 2000). In consecinta, in tractusul gastrointestinal, complexul bacteriimicotoxine este rapid excretat. Utilizarea acestor LAB poate fi benefica pentru oamenii si animalele expuse in mod constant la micotoxine prin reducerea absorptiei acestor toxine si cresterea excretiei micotoxinelor legate de celulele bacteriene.

Degradarea fungica a micotoxinelor

Detoxificarea micotoxinelor de catre drojdii capabile sa produca fermentatie

Fermentatia este una din cele mai vechi forme de procesare si conservare a hranei din lume, inca de acum 7000 de ani in Babylon (Battcock si Azam-Ali, 1998). In plus, fermentatia este una din cele mai usoare si ieftine metode de conservare a hranei, pe langa beneficiile sale asupra calitatilor nutritionale si organoleptice ale alimentelor fermentate. Consumul de alimente fermentate este adanc inradacinat in cultura africana si asiatica unde cerealele fermentate reprezinta o parte importanta a dietei zilnice. Fermentatia este realizata de microbiota naturala a materiilor prime, de microorganismele care provin din echipamentele de fermentatie sau de culturile adaugate din exterior. Microorganismele predominante care produc fermentatia cerealelor sunt pe langa bacteriile acidolactice, drojdiile, in special S. cerevisiae si Candida krusei (Jespersen si colab., 2003). S-a demonstrat ca unele tulpini de S. cerevisiae var. bourardii au o activitate probiotica (Coeuret si colab., 2004). Recent, s-a demonstrat ca o tulpina de S. cerevisiae izolata din produsele alimentare indigene africane are un potential probiotic promitator (van der Aa Kuhle si colab., 2004). In plus, drojdiile au fost administrate animalelor de sute de ani, iar produsele comerciale pe baza de drojdii sunt produse la scara comerciala pentru nutritia animala (Celyk si colab., 2003). Drojdiile au un potential imens de a fi utilizate in reducerea efectelor micotoxinelor in alimentele pe baza de cereale si in furajele destinate animalelor. Intr-un workshop FAO/WHO realizat in domeniul fermentatiei a fost subliniata necesitatea obtinerii de date stiintifice pe diferite aspecte ale fermentatiei alimentelor, incluzand legarea toxinelor (Nout si Motarjemi, 1997).

Aflatoxina

Nu exista multe studii privitoare la capacitatea fermentatiei de a reduce concentratia de aflatoxine in alimente. Intr-un studiu recent (Tabel 1), izolatele de drojdii apartinand diferitelor specii incluzand S. cerevisiae si Candida krusei au fost testate pentru capacitatea de a lega aflatoxina. Unele izolate din porumbul provenit din Africa au fost capabile sa lege mai mult de 60% (w/w) din toxina adaugata in PBS (Tabel 3).

Tabel 3. Abilitatea de legare a aflatoxinei de catre diferite tulpini de drojdii (dupa Shetty si colab., 2006)

^*10 8 celule incubate in 1 ml PBS continand 5 mg de aflatoxina B1 pentru 72 h la 250

Majoritatea tulpinilor de drojdii leaga mai mult de 15% (w/w) din aflatoxina B1 si legarea toxinei a fost dependenta de tulpina. Desi sunt multe studii legate de utilizarea drojdiilor sau a peretelui drojdiilor in experimente de nutritie, care au avut drept rezultat diferite grade de protectie fata de toxicitatea indusa de micotoxine, nu exista un raport specific asupra tulpinilor specifice de S. cerevisiae care leaga aflatoxinele in conditii de laborator. La pasari, S. cerevisiae a fost utilizata ca fiind un promotor de crestere si s-a demonstrat ca ar avea efecte benefice fata de expunerea la aflatoxina B1 (Celyk si colab., 2003; Devegowda si colab., 1998; Stanley si colab., 1993). Exista multe rapoarte asupra utilizarii peretelui celular al drojdiilor obtinut de la fabricile de bere, ca aditivi furajeri in dieta pasarilor determinand ameliorarea efectelor toxice ale aflatoxinei (Santin si colab., 2003).

Cand drojdiile uscate si peretele celular al drojdiilor a fost adaugat in ratia sobolanilor impreuna cu aflatoxina B1, a fost observata o reducere semnificativa a toxicitatii (Baptista si colab., 2004). Intr-un studiu in vitro care a utlizat perete celular de drojdii, s-a obtinut o legare dependenta de doza, care a atins un procent maxim de 77% (w/w) si manan-oligozaharidele derivate din celulele de S. cerevisiae au determinat o legare de 95% (w/w) (Devegowda si colab., 1996). Un studiu ulterior a confirmat efectul protector al glucomananilor din drojdii asupra aflatoxicozei la pui (Karaman si colab., 2005). Pe de alta parte, la sobolanii hraniti cu drojdii uscate si manan-oligozaharide, manan-oligozaharidele nu au putut ameliora modificarile induse de aflatoxina (Baptista si colab., 2004). Aceste rezultate contrazic rezultatele obtinute de Devegowda si colab. (1996), dar pana in prezent nu a putut fi data nici o explicatie referitoare la aceste diferente.

Aflatoxinele nu au fost detectate in berea produsa in Europa. Scott si Lawrence (1997) care au analizat toate tipurile de bere comercializate in USA si Mexic, au raportat ca doar o proba a continut o concentratie mica de aflatoxina.

Ochratoxina

Grunkemeier (1990) a aratat ca un amestec de 40% (w/w) drojdii sterilizate si 60% (w/w) reziduu de fermentatie provenit de la fabricarea berii au avut o capacitatea mare de a lega ochratoxina A intr-un studiu de adsorbtie in vitro. Legarea a fost dependenta de pH si a fost maxima la pH 3.0, indicand ca legarea fizica de peretele celular ar fi responsabila pentru inlaturarea ochratoxinei. Un studiu recent (Bejaouii si colab., 2004) sugereaza ca tulpinile de Saccharomyces implicate in fermentarea vinului pot fi utilizate pentru decontaminarea ochratoxinei A in mustul natural si sintetic. Caldura favorizeaza adsorptia, intrucat drojdiile distruse prin caldura leaga in procent mai mare toxina (90% w/w) comparativ cu celulele viabile (35% w/w) indicand ca natura fizica a legarii si densitatea celulara joaca un rol important in eficienta adsorptiei. Adsorptia este un proces eficient intrucat 90% (w/w) din toxina a fost legata in primele 5 minute. Aceasta lucrare indica faptul ca drojdiile pot fi agenti de decontaminare pentru ochratoxina A in must. In plus, celulele moarte pot fi utilizate pentru indepartarea ochratoxinei A din must, intrucat drojdiile nu ridica probleme de calitate sau securitate (Bejaouii si colab., 2004). Intr-un alt experiment, Scott si colab. (1995) au studiat rolul fermentatiei asupra continutului de ochratoxina A. Dupa 8 zile de fermentatie, tulpinile de Saccharomyces utilizate, au determinat o scadere de 13% pentru ochratoxina A.

Caridi si colab. (2006) au testat capacitatea a douazeci de tulpini de Saccharomyces de a inlatura ochratoxina A dintr-un mediu sintetic continand 1.1 ng/mL (aproximativ jumatate din limita Uniunii Europeene) ochratoxina, si a fost evaluata utilizand patru pana la sase mg de biomasa de drojdie (greutate umeda/mL). Sapte tulpini au prezentat o capacitate mare de inlaturare a ochratoxinei A, cuprinsa intre 0.72 si 1.10 ng/mL, echivalentul a 66 pana la 100% din toxina disponibila, cu o capacitate de inlaturare cuprinsa intre 14.31 si 27.24 pg/mg biomasa. Cercetari viitoare vor fi necesare pentru a studia mecanismul de inlaturare al OTA si pentru a confirma abilitatea celor mai eficiente tulpini de Saccharomyces de a inlatura OTA din mustul contaminat in cursul fermentatiei alcoolice.

Alte studii, au aratat ca glucomannanii leaga de asemenea cantitati semnificative de ochratoxina in prezenta aflatoxinei (Raju si Devegowda, 2000). Aceast fapt indica posibilitatea existentei mai multor situsuri de legare ale micotoxinei de peretele celular. Este mult prea devreme pentru a interpreta aspectele mecanismelor de legare si sunt necesare alte studii pentru intelege interactia dintre micotoxine si diferitele componente ale peretelui drojdiei.

Pentru a investiga modul de adsorbtie al OTA de catre drojdii, Ringot si colab., (2007) au studiat procesul de adsorptie in vitro a OTA de catre trei sub-produse rezultate din industria care utilizeaza drojdii: un amestec continand perete celular de drojdie (EX16), un extract purificat de beta-glucan de drojdii (BETA) si o fractie din peretele celular de drojdii (LEC) la o temperatura de 250C. Sapte metode clasice de adsorbtie au fost testate pentru a furniza cea mai buna descriere a procesului de adsorptie al toxinei. Pe baza dimensiunii coeficientilor de determinare R2 pentru modelele lineare si valoarea sumei erorilor normalizate (SNE) pentru modelele lineare si non-lineare, s-a stabilit ca ecuatiile Hill, Freundlich si Brunauer Emmett Teller produc cele mai bune modele pentru bioadsorbtia OTA de catre cele trei sub-produse. Acest model propus de autori reprezinta o abordare de viitor pentru stabilirea celui mai bun model de adsorptie izoterma.

Fumonisina

Exista cateva studii asupra efectului fermentatiei berii si vinului asupra concentratiei de fumonisine (Scott si colab. 1995; Torres si colab., 2001). Scott si Lawrence (1995) au analizat 41 de beri canadiene pentru continutul in fumonisina. Majoritatea probelor au continut cantitati foarte mici de fumonisina, doar patru probe au continut mai mult de 2 ng/ ml de fumonizina B1 si 7,6 ng/ mL fumonizina B2. Prezenta fumonizinelor in berea spaniola a fost analizata de Torres si colab. (1995). Fumonizina a fost detectata in 43.8% din probele analizate la concentratii mici (4.76 ng/mL) care este evaluata ca nefiind toxica. Intr-un alt experiment, Scott si colab. (1995) au studiat rolul fermentatiei asupra continutului de fumonizina B1 si B2. Dupa 8 zile de fermentatie, tulpinile de Saccharomyces utilizate, au determinat o scadere de 28% si 17% pentru fumonizina B1, respectiv fumonisina B2. Manan-oligozaharidele derivate din celulele de S. cerevisiae au demonstrat o mare capacitate de legare a fumonisinei B1 (Shetty si Jespersen, 2006).

Trichotecenele

Manan-oligozaharidele derivate din celulele de S. cerevisiae au demonstrat o mica capacitate de legare a deoxinivalenolului (Shetty si Jespersen, 2006). S-a demostrat ulterior ca glucomananul esterificat ofera protectie puilor expusi la ochratoxina si toxina T-2, pe langa protectia oferita fata de aflatoxina (Raju si Devegowda, 2000) si reduce efectele toxice ale fusariotoxinelor la cabaline (Raymond si colab., 2003).

Efectele potentiale ale fermentarii etanolice realizate de catre drojdii asura fusariotoxinelor au fost studiate de Flesch si Voight-Scheuerman (1994) care au studiat efectul fermentatiei alcoolice a mustului asupra concentratiei de trichotecene. Au fost identificati derivati care nu au continut grupul epoxid, sugerand prezenta unei epihidroxilaze de drojdie. A fost de asemenea sugerat faptul ca drojdia produce probabil ligaze si de asemenea keto-enol tautomeraza. Ulterior a fost stabilit faptul ca o cantitate semnificativa de micotoxine (aproximativ 20%) a fost preluata de drojdie. Intrucat inelul 12, 13-epoxid al acestor compusi este responsabil de toxicitatea lor, o de-epoxidare produsa de enzime specifice (de-epoxidaze) este responsabila pentru pierderea semnificativa a toxicitatii.

Zearalenona

Cunoasterea interactiilor dintre drojdii si micotoxine dateaza de acum mai bine de 30 de ani (Ciegler si colab., 1966; Mann, 1977). La inceputul anilor optzeci, au aparut cateva studii legate de utilizarea porumbului contaminat cu zearalenona, pentru a produce etanol prin fermentatie si s-a observat ca toxina a fost recuperata din reziduurile solide (Bennet si colab., 1981). Manan-oligozaharidele derivate din celulele de S. cerevisiae au demonstrat o mare capacitate de legare a zearalenonei (Shetty si Jespersen, 2006). S. cerevisiae poate de asemenea lega zearalenona, iar principalele componente implicate in formarea complexului sunt ?-D glucanii (Yiannikouris si colab., 2004a, b).

Alte studii au aratat ca zearalenona a fost transformata in produse care prezinta acelasi potential estrogen in cursul fermentarii produse de drojdii (Matsuura si Yoshizawa, 1985; Scott si colab., 1992; Boeswald si colab., 1995).

Alte micotoxine

Degradarea partiala a patulinei a fost obtinuta si in urma inocularii silozului de secara cu drojdii (Dutton si colab., 1984).

Structura peretelui celular al drojdiei

Structura chimica si natura peretelui celular de S. cerevisiae a fost intens studiata (Klis, 1994; Klis si colab., 2002; Perez si Ribas, 2004). Peretele celular al drojdiei reprezinta aproximativ 30% (w/w) din greutatea totala a celulei si este o structura bi-stratificata, partea structurala fiind formata din ?-1,3-glucan si ?-1,6-glucan. Majoritatea proteinelor peretelui celular (manoproteine) sunt legate covalent de??-1,3-glucani prin lanturi de ?-1,6-glucani. Peretele celular (manoproteine) consta dintr-o clasa heterogena de glicoproteine din care au fost identificate 70. Fractia carbohidrat poate reprezenta 90% (w/w) din manoproteine. Manan oligozaharidele (MOS) constituie aproximativ 50% (w/ w) din carbohidratii totali. Din nucleul de proteine, pornesc lanturi extrem de ramificate de manoza (legate de resturi de asparagina) si lanturi inmanuchiate scurte si rigide de tip oligomanozil (pe resturile de serina si treonina). Resturile manozil pot fi adesea fosforilate. O alta trasatura importanta este faptul ca puntea de fosfodiester din lanturile de manozil contribuie la sarcina negativa a suprafetei celulare. In plus, peretele celular este o structura foarte dinamica care raspunde rapid la schimbarile de mediu si la stres (Aguilar-Uscanga si Francois, 2003; Kapteyn si colab., 1999; Klis si colab., 2002). Bazandu-ne pe compozitia chimica si natura fizica a peretelui de S. cerevisiae, se poate ajunge la concluzia ca suprafata celulara prezinta un numar foarte mare de situsuri de adsorptie pe suprafata sa.

Natura legaturilor si mecanismul de legare

Se cunoaste faptul ca drojdiile pot lega diferite molecule cum ar fi toxine, ioni metalici, sub forma de structuri complexe care se leaga de suprafata peretelui celular (Brady si colab., 1994; Bolognani si colab., 1997; Breierova si colab., 2002; Orrihage si colab., 1994; Santos si colab., 2000). Peretele celular este cunoscut prin capacitatea de legare a sterolilor (Adams si Parks, 1967) iar molecula de legare a fost identificata ca fiind mananul peretelui celular (Thompson si colab., 1973).

Pe baza unor cercetari recente, a fost confirmat faptul ca inlaturarea micotoxinelor s-a realizat prin aderarea la componentele peretelui celular mai degraba decat prin legarea covalenta sau prin metabolism, intrucat celulele moarte nu isi pierd capacitatea de legare (Baptista si colab., 2004; Celyk si colab., 2003; Raju si Devegowda, 2000; Santin si colab., 2003). Rezultatele din literatura indica faptul ca componentele de tip manan ale peretelui celular joaca un rol major in legarea aflatoxinei de catre S. cerevisiae (Devegowda si colab., 1996). Mai sunt insa necesare multe studii cinetice cu celule vii sau modificate fizico-chimic de celulele S. cerevisiae pentru a determina rolul diferitelor componente ale peretelui celular in legarea micotoxinei. Raju si Devegowda (2000) au aratat ca mananii pot lega alte micotoxine cum ar fi ochratoxina A si toxina T-2. Yiannikouris si colab., (2003, 2004a,b) au aratat ca zearalenona leaga ?-D-glucani si alt studiu (Freimund si colab., 2003) a demonstrat ca ?-1,3-glucanii de drojdie prezinta o capacitate mai mare de a lega toxina T-2 in comparatie cu zearalenona.

Faptul ca legarea ochratoxinei este de asemenea mai mare cand drojdiile sunt inlocuite cu un extract de perete celular (Huwig si colab., 2001) sau cu celule tratate termic si inlaturarea rapida a toxinei din mediul lichid (Bejaoui si colab., 2004) indica natura fizica a procesului de adsorptie. Yiannikouris si colab., (2004c) au publicat un studio complex legat de interactiile dintre zearalenona si ?-D glucani, pe baza unor studii care au utilizat RMN si razele X. Interesant, lanturile de ?-1,3 D-glucan favorizeaza o asociatie foarte stabila intra-helicala cu zearalenona, complex stabilizat de lanturile de ?-1,6 D-glucan. Identificarea prezentei in complex a legaturilor de hidrogen cat si a interactiilor van der Waals va permite utilizarea lor pentru a monitoriza asocierea dintre cele doua molecule.

Abilitatea de legare a micotoxinelor de catre S. cerevisiae in tractusul gastro-intestinal

Posibila utilzare a S. cerevisiae ca agenti de legare ai micotoxinelor in hrana umana si animala depinde de stabilitatea complexului in tractusul gastro-intestinal si de timpul petrecut. In general, S. cerevisiae prezinta o aderenta scazuta la intestin (van der Aa Kuhle et al., 2004), dar care are un inalt grad de specificitate. Celulele de S. cerevisiae sunt capabile sa se opuna mediului din tractusul gastro-intestinal, desi unele tulpini sunt inlaturate din sistem relativ repede (Lewis si Freedman, 1998). Experimentele de nutritie cu drojdie vie si perete celular (Celyk si colab., 2003; Santin si colab., 2003) au aratat ca adaugarea de S. cerevisiae in dieta a dus la scaderea toxicitatii micotoxinelor, indicand stabilitatea complexului drojdie-micotoxina in tractusul gastro-intestinal. Yiannikouris si colab., (2004d) au evaluat rolul ?-D-glucanilor in adsorptia zearalenonei la pH 3, 6 si 8 care poate fi intalnit in tractusul digestive uman. Conditiile acide si neutre favorizeaza adsorbtia toxinei (6477%) de catre ?-1, 3-D-glucani, in timp ce conditiile alcaline descresc adsorptia. Conditiile alcaline par sa impiedice conformatia activa tri-dimensionala a ?-D-glucanilor si favorizeaza structurile cu un singur helix si/sau structurile infasurate. Studiul echilibrului dintre ?-D-glucanul legat si toxina libera a evidentiat existenta a doua tipuri de interactii chimice care se produc in cursul formarii complexului dintre toxina si ?-D glucani, identificati ca fiind legaturi slabe cum ar fi legaturile de hidrogen si fortele van der Waals.

Detoxificarea micotoxelor de catre microflora simbiotica a nevertebratelor

O tulpina simbiotica de drojdii, Pseudotaphrina kochii, capabila sa degradeze o diversitate de micotoxine si xenobiotice a fost izolata din carabusul de tigareta. Tulpina creste pe un mediu cu citrinina, DON, acid micofenolic, ochratoxina A si sterigmatocistina, ca unica sursa de carbon, iar cresterea pe un mediu cu zearalenona a fost descris ca variabil (Dowd si Shen, 1990; Shen si Dowd, 1991). Oricum, nu a fost observata cresterea tulpinii de P. kochii pe un mediu solid minimal continand DON sau zearalenona dupa 17 saptamani si nu a fost detectata o activitatea de degradare a DON-ului sau zearalenonei - in culturile lichide care utilizeaza tulpina originala NRRLY-18546 (Karlovsky, 1999). Explicatii posibile privitoare la aceasta discrepanta sunt reprezentate de degenerarea abilitatilor metabolice ale tulpinii in culturile stoc sau prezenta impuritatilor in agarul utilizat de Dowd si Shen, care au facilitat utilizarea DON-ului si zearalenonei in aceste experimente.

Detoxificarea micotoxinelor de catre drojdiile isolate din mediu

Ochratoxine

Peteria si colab., (2007) au studiat capacitatea unor drojdii izolate de pe frunzele unor copaci - Phaffia rhodozyma si Xanthophyllomyces dendrorhous de a degrada ochratoxina A. P. rhodozyma CBS 5905 a degradat mai mult de 90% din ochratoxina A (OTA) in 15 zile la 200C. Datele prezentate indica ca P. rhodozyma este capabil sa converteasca OTA la ochratoxin ?, si ca aceasta conversie este posibil mediata de o enzima legata de carboxipeptidaze. Agentii de legare, cum ar fi EDTA si 1,10-fenantrolina inhiba degradarea OTA determinata de P. rhodozyma indicand ca carboxipeptidaza este o metaloproteaza, similara carboxipeptidazei A. Temperatura optima de actiune a acestei enzime este la aproximativ 30 0C, temperatura care este mai mare decat temperatura optima de crestere pentru celulele de P. rhodozyma, care este in jur de 200C. Enzima responsabila de degradarea ochratoxinei este legata de celulele de drojdii. In plus, atat celulele viabile cat si cele tratate termic de P. rhodozyma au fost de asemenea capabile sa adsoarba cantitati semnificative (de pana la 250 ng ml_1) de OTA. Tratamentul termic a determinat cresterea capacitatii de adsorbtie a OTA de catre celule.

Un alt grup de cercetatori au izolat si caracterizat o noua tulpina de drojdii, capabila sa degradeze ochratoxina A (Bruinink, si colab., 1999; Schatzmayr si colab., 2006). Data fiind afilierea drojdiei la genul Trichosporon si proprietatea sa de a degrada micotoxinele, aceasta tulpina a fost numita Trichosporon mycotoxinivorans (Trichosporon MTV, 115).

Zearalenona

Tulpina de Trichosporon mycotoxinivorans (Trichosporon MTV, 115) capabila sa degradeze ochratoxina A este capabila sa degradeze si zearalenona (Bruinink, si colab., 1999; Schatzmayr si colab., 2006).

Detoxificarea enzimatica poate fi o metoda eficienta pentru detoxificarea ZEN. In 2002, un grup de cercetatori a izolat o gena care detoxifica ZEN, zhd101, din drojdia Clonostachys rosea (Takahashi-Ando si colab., 2002). ZHD101 converteste ZEN intr-un produs nonestrogen 1-(3,5-dihidroxi-phenil)-10-hydroxy-1-undecen-6 -ona la un pH alcalin pH (Kakeya si colab., 2002).

3. Rezultatele proiectului privind utilizarea unor biotehnologii alimentare in combaterea contaminatilor alimentari

4. Implicatiile pentru industria alimentara si consumatori Perspective ale cercetarii

Micotoxinele contamineaza frecvent materiile prime cum ar fi cerealele, fructele, nucile, condimentele, laptele si carnea la diferite niveluri. De aceea este absolut obligatoriu controlul concentratiei de micotoxine. In mod normal, concentratiile scazute de micotoxine in alimente sunt mentinute prin utilizarea unor materii prime lipsite de micotoxine sau contaminate cu concentratii mici de micotoxine (Pittet, 1995).

In ciuda acestor eforturi, contaminarea sporadica cu micotoxine a fost raportata in produse alimentare ca vin, bere, lapte si produse lactate (Blesa si colab, 2004; Elgerbi si colab, 2004; Odhav si Naicker, 2002). Tulpinile de S. cerevisiae cu capacitate mare de legarea a micotoxinelor pot fi utilizate ca parte a culturilor starter in procesele de fermentatie a hranei si bauturilor, sau pretele celular purificat de S. cerevisiae pot fi utlizate ca aditivi in cantitati scazute fara a compromite caracteristicile produsului final. Mai important, S. cerevisiae sunt microorganismele majoritare implicate in fermentatia alimentara in tarile tropicale cu concentratii mari de micotoxine in hrana. Tulpinile de S. cerevisiae izolate din hrana natural fermentata pot fi utilizate ca si culturi starter cu capacitati suplimentare pentru a decontamina micotoxele din hrana. Dat fiind interesul crescut pentru utilizarea nicroorganismelor probiotice in lume, cu potential crescut de a lega micotoxinele si capacitati probiotice pot avea un rol extreme de important in reducerea expunerii la micotoxina.

S. cerevisiae, cele mai important microorganism implicate in fermentatie, sunt capabile sa lege diferite micotoxine de peretele celular. Acest mod de decontaminare al micotoxinelor este promitator, desi domeniul este inca la inceput. Desi exista multe tulpini de bacterii acido-lactice cu capacitati crescute de a lega toxine, nu sunt multe tulpini de S. cerevisiae, caracterizate pentru capacitatea de a lega toxina. Astfel, este necesara testarea unui numar cat mai mare de tulpini de S. cerevisiae de origine alimentara pentru capacitatea de a lega micotoxinele (Shetty si Jespersen, 2006).

Datele de literatura referitoare la mecanismul de legare al diferitelor micotoxine la peretele celular si natura complexului nu sunt suficiente, in special cele referitoare la S. cerevisiae. Mai multe studii privitoare la interactiile chimice si stabilitatea complexului, in special in conditiile dificile din tractusul gastro-intestinal necesita alte investigatii. Este cunoscut faptul ca legarea toxinei de S. cerevisiae sunt dependente de tulpina si astfel, este important sa se inteleaga bazele moleculare ale legarii diferitelor micotoxine. Interactiile dintre culturile cu un inalt potential de legare al micotoxinelor si celulele intestinale necesita o investigare mai in detail inainte de utilizarea acestor tulpini ca organisme de legare.

Tulpinile de S. cerevisiae cu capacitate mare de a lega micotoxinele vor fi utilizate in viitor ca organisme capabile sa lege micotoxinele. Culturile starter bine caracterizate ca si biomasa tulpinilor care leaga micotoxinele pot fi utilizate eventual in tarile in curs de dezvoltare de la tropice pentru a diminua expunerea la micotoxine si a imbunatati sanatatea animala.

5. Concluzii si recomandari pentru fermieri