RO 
EN 
Proiectul TE-4
Proiect Resurse Umane
Titlul proiectului:Rolul ochratoxinei A in declansarea nefropatiei endemice balcanice prin utilizarea porcului ca model animal
Tipul proiectului: Proiecte de Cercetare pentru Stimularea Constituirii de Tinere Echipe de Cercetare Independente
Cod proiect: PN-II-RU-TE-2012-3-0086
Nr. contract: TE 4
Unitatea Finantatoare: UEFISCDI
Rezumat:
Proiectul investigheaza implicarea ochratoxinei A in nefropatia balcanica endemica. Proiectul va evalua efectele OTA la nivel celular si molecular, cu privire la cresterea si diviziunea celulara, stresul oxidativ si raspunsul inflamator, si va reprezenta o abordare originala, inovatoare a acestui subiect in Romania. Rezultatele vor constitui baza stiintifica pentru schimbarile induse de OTA in rinichi si la nivelul intregului organism, ele putand fi corelate cu observatii clinice ale nefropatiei balcanice, dovedind sau nu implicarea OTA in aceasta boala. Pe langa beneficiile nationale, ale analizelor de risc efectuate pe parcursul proiectului, acest proiect va contribui la consolidarea bazei de date europene cu privire la efectele toxice celulare si moleculare ale OTA la animale; acest lucru va permite consolidarea legislatiei UE privind siguranta alimentara si emiterea de noi reglementari UE cuprivire la limitele de toleranta a OTA in hrana animalelor, stiind ca pana acum nu exista decat o recomandare a UE (Recomandarea CE 576/2006) cu privire la limitele de toleranta a concentratiei OTA in furaje. Regulamentul privind concentratiile maxim admise pentru OTA va elimina de la consum alimente cu concentratii de OTA mai mari decat cea mai mare concentratie permisa. In acelasi timp, cresterea sigurantei si securitatii alimentare va imbunatati starea de sanatate a animalelor si, implicit, a populatiei umane.
Obiective:
Obiectivul general al acestui proiect se bazeaza pe doua argumente importante si originale i) necesitatea de a aprofunda implicarea ochratoxinei in Nefropatia endemica balcanica (BEN) prin investigarea mecanismelor de actiune celulare si moleculare ale acestei micotoxine la nivel renal. Rinichiul este organul tinta al OTA si principala caracteristica importanta a BEN este formarea de tumori multiple bilaterale in partea superioara a tractului urinar. Dupa cum este cunoscut, celulele tumorale sufera modificari ale expresiei genelor asociate unor procese metabolice importante (proliferarea si diferentierea celulara, apoptoza, etc). OTA a fost putin studiata in ceea ce priveste efectele asupra cailor de semnalizare. (NF-kB si MAPK-inases). ii) lipsa de date stiintifice si clinice in Romania. Acesta este motivul pentru care Romania apare foarte rar in rapoartele EU (cum ar fi SCOOP), care prezinta periodic nivelul de contaminare si incidenta contaminarii cumicotoxine in tarile membre UE; foarte putine date de contaminare cu OTA si privitoare la incidenta nefropatie balcanice provin din Romania. In plus, climatul temperat din Romania, cu veri calde, in special in ultimii ani, favorizeaza dezvoltarea mucegaiuri Aspergillus si sinteza de micotoxine. Proiectul va utiliza porcul ca model animal si va combina studii in vitro (culturi de porc celulele epiteliale renale si celulele sanguine), cu studii vivo (studii pe porci) pentru a intelege mecanismele de actiune de OTA la nivel celular si molecular. Intr-o prima etapa vor fi evaluate modificarile produse de OTA in vitro pe MAPKinases (ERK1/2, p38 si JNK) si NFk-b (p65), cai celulare de semnalizare cu un rol important pentru progresul proceselor fiziologice vitale ca proliferarea, apoptoza, inflamatia, etc. Acest set de informatii vor fi corelate cu : (i) proliferarea celulara, necroza si apoptoza (ii) stresul oxidativ, (iii) procesele inflamatoare. Investigatiile in vivo vor incepe de la ipoteza mentionata in introducere, prin care ingestia de alimente contaminate cu OTA modifica metabolismul animal in general si fiziologia renala in special, ceea ce induce imunosupresie. Consecinta este o sensibilitate mai mare la infectii. Utilizarea metodelor moderne de investigare in vitro, utilizind anumite linii celulare ex : LLC-PK si modele in vivo impreuna cu expertiza membrilor echipei de cercetare, va permite o mai buna intelegere a modului in care OTA actioneaza, la nivel local (rinichi) si la nivel sistemic (sange).
Derularea activitatilor:
|
An
|
Obiective
|
Activitati
|
|
2013
|
1. Investigarea efectelor stresului toxic Indus de OTA asupra cresterii si diviziunii celulare. | Determinarea activitatii succinat dehidrogenazei mitocondriale in celulele metabolic active |
| Determinarea alterarii expresiei proteinelor implicate in cresterea celulara, diferentiere si apoptoza (ERK1/2, c-Jun N-terminal kinases, p38) | ||
|
2014
(2016) |
1. Estimarea toxicitatii OTA in inducerea stresului oxidativ. | Investigatii privind inducerea stresului oxidative in vitro |
| Investigatii privind inducerea stresului oxidative in vivo (Intoxicarea experimentala in vivo cu OTA) | ||
|
2015
|
1. Evaluarea amplitudinii raspunsului inflamator indus de OTA. | Studiul expresiei unor marker importanti ai inflamatiei: sinteza de citokine pro-inflamatoare (IL1-b, IL-8, TNF-alpha) si anti-inflamatoare (IL4, IL-10) |
| Determinarea spectrofotometrica a profilului biochimic | ||
| Determinarea altor markeri serici ai inflamatiei |
Rezultate asteptate:
Proiectul va avea ca rezultat obtinerea de date privind efectele OTA la nivel celular si molecular, referitoare la proliferarea si diviziunea celulara, stresul oxidativ si raspunsul inflamator, reprezentand o abordare originala a acestui subiect in Romania. Rezultatele vor furniza o baza stiintifica pentru modificarile induse de OTA in rinichi si la nivelul intregului organism. Aceste rezultate vor fi corelate cu observatii clinice privitoare la nefropatia balcanica, dovedind sau nu implicarea OTA in aceasta boala. Pe langa beneficiile nationale, analizele de risc realizate in timpul proiectului vor contribui la consolidarea (finalizarea) bazei de date a UE privitoare la efectele toxice ale OTA la animale. Acest lucru va permite consolidarea legislatiei UE legata de siguranta alimentara si va permite stabilirea unui regulament al UE privind limitele maxim admise de OTA in hrana animalelor, stiind ca pana in prezent exista doar o recomandare EU (CE recomandarea 576 / 2006) privind limitele OTA in furaje. Acest regulament va permite eliminarea cerealelor si a altor materii prime contaminate cu concentratii mai mari de OTA decat cea admisa de la consum. In acelasi timp, cresterea sigurantei si securitatii alimentare va imbunatati starea de sanatate a animalelor si, implicit, a populatiei umane
Stadiul proiectului si rezultate obtinute:
Etapa 1. Investigarea efectelor stresului toxic indus de OTA asupra cresterii si diviziunii celulare (mai 2013-decembrie 2013)
Obiective:
- Determinarea activitatii succinat dehidrogenazei mitocondriale in celulele metabolic active
- Selectia concentratiilor de OTA fara potential citotoxic
- Determinarea alterarii expresiei proteinelor implicate in cresterea celulara, diferentiere si apoptoza (ERK1/2, c-Jun N-terminal kinases)
In acesta prima etapa a fost evaluat efectul citotoxic al OTA asupra proliferarii celulare si mecanismele implicate in proliferarea si diferentierea celulara utilizand o linie de celulele epiteliale renale (LLC-pK). Rezultatele au aratat ca OTA are efecte diferite asupra expresiei genelor implicate in caile de semnalizare a MAPKs, cu implicatii importante pentru cresterea celulara, diferentiere si apoptoza.
Etapa 2:Estimarea toxicitatii OTA in inducerea stresului oxidative (ianuarie - decembrie 2014)
Obiective:
- 1. Intoxicarea experimentala in vivo cu OTA
- 2. Determinarea a diferitilor markeri ai stresului oxidativ in vitro (in linii de celule epiteliale intestinale) si la nivel sistemic (plasma)
Inflamatia si stresul oxidativ sunt strans corelate, caile care genereaza mediatorii inflamatiei fiind induse de stresul oxidativ. Cu toate acestea putine studii au investigat rolul stresului oxidativ si inflamatiei in declansarea nefropatiei endemice balcanice. In etapa de fata am investigat efectul OTA asupra stresului oxidativ si inflamatiei utilizand doua modele, un model in vitro - linia epiteliala IPEC si unul in vivo la purceii dupa intarcare. Rezultatele obtinute in acesta etapa au aratat ca OTA poate interfera cu capacitatea de aparare antioxidanta si cu raspunsul imun al organismului la nivel intestinal, cu importante implicatii pentru patologia nefropatiei endemice balcanice.
Etapa 3: Evaluarea amplitudinii raspunsului inflamator indus de OTA(ianuarie - decembrie 2015)
Obiective:
- 1. Studiul expresiei unor markeri importanti ai inflamatiei
Industria alimentara sufera pierderi economice importante datorate intoxicatiei cu micotoxine. Porcii, in particular, sunt foarte sensibili la intoxicatia cu micotoxine si reprezinta in particular un model bun pentru intoxicatia cu micotoxine la om. In acesta etapa a fost evaluat efectul inflamator al OTA in ficatul si rinichii purceilor intarcati intoxicati experimental cu toxina. Rezultatele noastre au aratat ca prezenta OTA in concentratie de 50 ppb, ca valoare recomandata de UE la purceii intarcati pentru o perioada de 33 zile este responsabila de hepatotoxicitate asa cum rezulta din cresterea concentratiei trigliceridelor, a activitatii transaminazei hepatice ALAT in plasma si a enzimei de stresoxidativ (SOD) in ficat, impreuna cu o scadere a concentratiei de plasma a proteinei totale si albuminei. Aceste alterari sunt asociate cu o scadere semnificativa a sintezei de IL-6 si de oxidnitric in ficat si o crestere semnificativa a sintezei de IL-10 in rinichi, ca markeri importanti ai inflamatiei. Rezultatele obtinute in aceasta faza au aratat ca OTA poate interfera cu raspunsul inflamator in ficat si rinichi, cu importante implicatii pentru patologia BEN.
Etapa 4: Estimarea toxicitatii OTA in inducerea stresului oxidativ
Studiul expresiei unor markeri importanti ai stresului oxidative(ianuarie - septembrie 2016/p>
- 1. Determinarea a diferitilor markeri ai stresului oxidativ in vitro (in celule sanguine) si in vivo (la nivel renal)
Stresul reprezinta reactia corpului la stimuli care perturba echilibrul fiziologic normal sau homomeostazia, adesea cu efecte negative asupra sanatatii. Acest stres se poate traduce la nivel celular prin declansarea stresului oxidativ, caracterizat prin producerea de radicali liberi (ROS).Ochratoxina A este o micotoxina care are efecte in special nefrotoxice la multe specii, iar degradarea oxidativa poate contribui la unele din aceste efecte distructive. In acesta etapa a proiectului am analizat capacitatea unei concentratii scazute de OTA de a induce stresul oxidativ prin studii in vitro si in vivo.OTA a indus scaderea capacitatii netrofilelor de a fagocita particulele de latexOTA si a avut un efect inhibitor asupra concentratiei de anion superoxid in sangele total sau in celulele izolate, proces care a fost direct proportional cu cresterea concentratiei de toxina Studiile in vivo, au aratat ca intoxicatia cronica timp de 33 zile a puceilor cu OTA a determinat o scadere semnificativa a concentratiei de NO in plasma, modularea productiei de NO putand juca un rol important in reglarea angiogenezei ?i in consecinta in progresia tumorala. Analizele de microarray efectuate pe rinichii animalelor control si expuse la OTA, au identificat 796 de transcripte semnificativ alterate in rinichii animalelor expuse la OTA fata de animalele control ; dintre acestea, 310 au fost up-regulate si 486 down-regulate. Caile canonice cele mai afectate identificate de IPA ca fiind cele mai asociate cu toxicitatea OTA au fost semnalizarea CD28 in celulele T helper; rolul NFAT in reglarea raspunsului imun, semnalizarea relaxinei, semnalizarea prin Familia Rho GTPaze, semnalizarea IL-1. Rezultatele noastre au aratat ca chiar si la concentratii mici, expunerea cronica de scurta durata la OTA poate afecta caile mediate de Nrf2- si interfera cu expresia unor gene implicate in stresul oxidativ. Asa cum a rezultat din experimental nostru, OTA a fost responsabila pentru o crestere in rinichi a activitatii SOD, o enzima implicata in apararea contra stresului oxidativ. In concluzie rezultatele noastre au aratat ca stresul oxidativ reprezinta o componenta importanta a toxicitatii induse de OTA si este asociat cu fenomene inflamatorii si de toxicitate renala.
Publicatii si comunicari:
- D.E. MARIN, I. TARANU, G. PISTOL. 2014. Metode de decontaminare a micotoxinelor. Editura Inovativ Media.
- D. E. MARIN, Ionelia TARANU. 2015. Ochratoxin A andits effects on immunity. Toxin Reviews. 34, 1, 11-20.
- D.E. MARIN,M. MOTIU, G.C. PISTOL, M.A. GRAS, F. ISRAEL-ROMING, L. CALIN, M. STANCU, I. TARANU. 2016. Diet contaminated with ochratoxin A at the highest level allowed by EU recommendation disturbs liver metabolism in weaned piglets. World Mycotoxin Journal, In Press, pp. 1 10
- D.E. MARIN, BRAICU C., GRAS M.A., PISTOL G.C., COJOCNEANU-PETRIC R., BERINDAN NEAGOE I., HABEANU M., TARANU I. A. 2016.Low level of ochratoxin A affects Genome-Wide Expression in Kidney of Weanling Piglets, BMC Genomics, in evaluation.
- D.E. MARIN, G. C. PISTOL, M.A.GRAS, M. MOTIU, I. TARANU. 2015. Studies concerning the nephrotoxic effects of ochratoxin a using pig as a model. Lucrari Stiintifice - Seria Zootehnie, Iasi, p333-337.
- D.E. MARIN, M. MOTIU, I. TARANU. Effect of Ochratoxin A and Aristolochic Acid on an Epithelial Intestinal Cell Line. Bulletin USAVM-CN Animal Science and Biotechnologies 71(2)/2014.
- D.E. MARIN, M. GRAS, G. PISTOL, I. TARANU. 2014. Effect of the mycotoxin ochratoxin A on the expression of some genes involved in the MAPKs pathway. 7th Immunonutrition Workshop,29.04-3.05, Carovigno, Italy.
- D.E. MARIN, BRAICU C., GRAS M.A., PISTOL G.C., COJOCNEANU-PETRICR., BERINDAN NEAGOE I.,HABEANU M., TARANU I. A. 2016. Cereal Contaminant Affects Genome-Wide Expression inKidney of Weanling Piglets. 10th Annual Meeting ofInternational Society of Nutrigenetics/Nutrigenomics, 22-26 May, Tel Aviv, Israel.
- D.E. MARIN, G. PISTOL, M. GRAS, M. MOTIU, I. TARANU. 2015. Ochratoxin A modulates inflammation in the spleen of weanling piglets, 13th International Symposium of Animal Biology and Nutrition, 15.10.2015, Balotesti, Romania
- D.E. MARIN. 2015. Studies concerning the safety of EU recommendations for mycotoxins in swine feed. ANIMAL FEEDING IN SOUTH EAST ASIA: CHALLENGES AND PROSPECTS; 2-9.11.2015, HaNoi Vietnam
- D.E. MARIN, G. PISTOL, M. GRAS, M. MOTIU, I. TARANU. 2015. Ochratoxin A, a food contaminant modulate inflammation in the liver of weanling A 12-a Conferin?a Europeana de Nutri?ie, FENS, 19-24.10.2015, Berlin Germania
- 6. D.E. MARIN, I. TARANU, CALIN L., TABUC C. 2014. Mycotoxins in feed and foods by-products.Workshop proiect colaborare bilaterala Romania Vietnam, 17-21.11.2014.
- D.E. MARIN, G. PISTOL, M. GRAS, M. MOTIU, I. TARANU. 2014. Ochratoxin A and immunity - implications for health. XII International Symposium of INCDBNA Balotesti, 14.11.2014. Balotesti, Romania
- D.E. MARIN, I. TARANU Manda G., 2013. Mycotoxins and metabolites,toxicity and implications, 2nd FoodSeg Symposium14-15.06.2013, Bucuresti Romania
- D.E. MARIN, M. A. GRAS, G. C. PISTOL, F. ISRAEL ROMING, I. TARANU.2016. Studiul toxicitatii concentratiilor scazute de ochratoxina utilizand porcul ca model animal.A 4-a Conferin?a Na?ionala de Micologie Medicala, Workshop-ul de Micotoxicologie, 9-10 sept, Bucuresti, Romania