Proiectul TE 302/2015

Proiect TE 302/2015

 

Titlul proiectului: Investigarea pre-, probioticelor ca modulatori ai microflorei si inflamatiei intestinale la porc ca model pentru inflamatia intestinala cronica umana
Acronim: GUTINFLAM

Tipul proiectului: Proiecte de Cercetare pentru Stimularea Constituirii de Tinere Echipe de Cercetare Independente
Cod proiect: PNII-RU-TE-2014-4-1287
Nr. contract: TE 302/2015

Unitatea Finantatoare: UEFISCDI

Director de proiect: Dr. Bioch. Gina Cecilia Pistol, CSII

 

REZUMAT:

Conceptul de sanatate umana cuprinde nu numai aspectele patologice, ci si relatia critica dintre bunastare si boala, si relevanta acestora pentru sanatatea publica. Dintre bolile cu un impact foarte mare asupra sanatatii publice, se pot enumera si bolile intestinale inflamatorii cronice (IBD), tulburari remisive si cronice ale tractului gastrointestinal. In ultimii ani se acorda o atentie sporita utilizarii produselor de oigine naturala ce pot preveni/atenua inflamatia in IBD. Printre cele mai promitatoare modalitati de a contracara inflamatia intestinala amintim utilizarea probioticelor (bacterii si drojdii) sau a ingredientelor bogate in compusi cu activitate biologica, cum ar fi polifenolii. In acest caz, sunt necesare mai multe studii aprofundate pentru a elucida impactul lor asupra reducerii prevalentei IBD. Pentru aceasta, am pus bazele unei echipe multidisciplinare ce va analiza impactul prebioticelor (polifenolii din tescovina) si probioticelor (Lactobacili sp.) asupra contracararii proceselor inflamatoare si modularii microflorei intestinale, utilizand porcul ca model animal pentru IBD uman. Efectele polifenolilor din tescovina si ale probioticelor vor fi evaluate prin studii in vitro si in vivo; de asemenea, va fi analizat modul in care polifenolii din tescovina in combinatie cu unele specii de Lactobacilli pot stimula raspunsul imun la nivelul mucoasei intestinale, putand astfel sa creasca potentialul de aparare si rezistenta la boli in cazul animalelor de ferma.

OBIECTIVELE PROIECTULUI:

Unul dintre obiectivele principale ale cercetarii bio-medicale este intelegerea complexitatii afectiunilor inflamatorii de la nivelul tractului gastrointestinal, cu referire la fiziologie, microflora si sistemul imun local. Din acest punct de vedere, prezentul proiect isi propune investigarea unor produsi naturali cu potential in imbunatatirea sanatatii gastrointestinale prin ameliorarea statusului inflamator in IBD. Obiectivul major al acestui proiect este studiul unor strategii si solutii nutritionale bazate pe utilizarea prebioticelor (tescovina) bogate in plofenoli si a probioticelor (Lactobaccillus sp.) cu proprietati antimicrobiene ca solutii alternative pentru prevenirea si/sau ameliorarea inflamatiei in IBD utilizand porcul ca model animal. Obiectivul strategic al proiectului consta in consolidarea unei echipe formata din tineri cercetatori, cu expertiza in imunologie, imunonutritie si nutritie animala care vor investiga efectele unor prebiotice (polifenoli) si probiotice (lactobacili) asupra prevenirii/reducerii amplitudinii inflamatiei intr-un model de inflamatie indusa experimental utilizand celule intestinale pentru studiile in vitro si porcul pentru studiile in vivo. Obiectivele specifice care urmeaza sa fie abordate in acest proiect sunt:

(1) dezvoltarea unui model animal pentru inflamatiile intestinale, utilizand porcul domestic, concentrandu-ne pe trei sisteme fiziologice principale: sistemul gastrointestinal si cel imun;

(2) evaluarea prin analize celulare si genomice a efectelor polifenolilor si lactobacililor asupra statusului inflamator local (expresia genelor si a markerilor celulari implicati in raspunsul inflamator intestinal)  studii in vitro si in vivo;

(3) corelarea rezultatelor de analiza genomica si celulara si identificarea unui set de gene si a unor markeri celulari de interes; corelarea rezultatelor privind efectele polifenolilor si lactobacililor asupra statustului inflamator cu efectele de la nivel molecular; interpretarea si sinteza rezultatelor finale;

(4) diseminarea rezultatelor catre comunitatea stiintifica din Romania si cea internationala, prin intermediul publicatiilor si comunicarilor stiintifice, catre agentiile de interes, Ministerul Sanatatii, asociatiile medicale din Romania si din Uniunea Europeana, medici si pacientii afectati de IBD.

STRATEGIA GENERALA A PLANULUI DE LUCRU:

Planul de lucru are o durata totala de 24 luni si a fost impartit in doua etape principale, destinate investigarii efectelor prebioticelor si probioticelor asupra prevenirii/atenuarii inflamatiei intestinale, utilizand metodologii in vitro si in vivo.

PLANUL DE LUCRU AL PROIECTULUI:

Anul I: 2015:

Activitati
Obiectiv: Caracterizarea prebioticelor
Extractia si caracterizarea chimica a polifenolilor din tescovina

Anul II: 2016:

Obiectiv: Explorarea efectelor prebioticelor si probioticelor utilizand modele celulare (abordari in vitro)
Efectele prebioticelor (polifenoli extrasi din tescovina) si ale probioticelor la nivel local, utilizand un model in vitro de inflamatie intestinala. Analiza inflamamtiei la nivel local intestinal. Prepararea probelor pentru analiza transcriptomica. Analiza prin microarray a expresiei genelor de porc. Validarea prin PCR in timp real a rezulatelor de microarray.

Anul III: 2017:

Obiectiv: Investigarea efectelor dietelor suplimentate cu pre- si probiotice asupra raspunsului imun la porci ca model animal pentru inflamatia intestinala (abordari in vivo)
Prepararea dietelor experimentale; Evaluarea efectelor pre-, probioticelor si a combinatiei dintre ele asupra raspunsului imun local si sistemic la porc ca model pentru IBD uman; Efectele diferitelor strategii de nutritie asupre statusului de activare al celulelor sangiune periferice, si asupra diferitelor subpopulatii de celule imune (citometrie in flux); Analiza proteomica pentru detectia de citokine in probele de plasma; Analiza efectelor pre- si probioticelor si a combinatiei dintre ele asupra microflorei intestinale
Obiectiv: Analiza datelor si analiza bio-statistica
Analiza bio-statistica a datelor obtinute in experimentele in vitro si in vivo

REZULTATE ESTIMATE:

Rezultatele estimate sunt:
(1) dezvoltarea unui model animal pentru inflamatiile intestinale, utilizand porcul domestic, concentrandu-ne pe trei sisteme fiziologice principale: sistemul gastrointestinal, cel imun si sistemnul cardiovascular;
(2) evaluarea prin analize celulare si genomice a efectelor tescovinei si probioticelor asupra statusului imun la porc (expresia genelor si a markerilor celulari implicate in raspunsul inflamator intestinal)  studii in vitro si in vivo;
(3) corelarea rezultatelor de analiza genomica si celulara si identificarea unui set de gene si a unor markeri celulari de interes; corelarea rezultatelor privind efectele tescovinei si probioticelor asupra statustului general de sanatate animala cu efectele de la nivel molecular; interpretarea si sinteza rezultatelor finale.

Rezultatele vor fi materializate prin:
(i) dovezi stiintifice care ar putea sprijini utilizarea tescovinei si probioticelor in scopul reducerii incidentei si amplitudinii afectiunilor gastrointestinale;
(ii) acumularea de cunostinte care ar putea duce la intelegerea patologiei inflamatiei si a cerintelor pentru stabilirea si mentinerea sanatatii intestinale;
(iii) dezvoltarea unor noi formule nutritionale eficiente in reducerea riscurilor pentru sanatate datorate afectiunilor gastrointestinale la animalele de ferma.

STADIUL PROIECTULUI SI REZULTATE OBTINUTE:

Faza 1/2015

Activitatea 1.1. Extractia si caracterizarea chimica a polifenolilor din tescovina

In etapa 1 a acestui proiect ne-am propus punerea la punct a unei metode de extractie a polifenolilor din tescovina si cuantificarea si caracterizarea chimica a polifenolilor extrasi din tescovina, in vederea utilizarii extractelor in experimentele in vitro pe celule cultivate, in etapa urmatoare.

Rezultate obtinute:

Extractele de tescovina analizate contin cantitati diferite de polifenoli totali, in functie de metoda de extractie. Conform rezultatelor prezentate, putem afirma ca extractia in acetona a prezentat cel mai mare randament din punct de vedere al recuperarii polifenolilor totali din tescovina. Cea mai crescuta activitate antiradicalica o prezinta extractul de tescovina in metanol:apa , iar cea mai redusa activitate antiradicalica o are extractul de tescovina in apa fiarta.

Utilizand caracteristicile de performanta obtinute dupa verificarea conformitatii metodei, a fost evaluat profilul polifenolic al extractului de tescovina. Dintre polifenolii identificati, cea mai mare concentratie a fos gasita in cazul acidului galic (67,58 g/ml).

In extractele de tescovina au fost identificati flavonoizi naturali ca (-)catechina, epicatechina, acidul galic, acidul cafeic, rutin, acidul elagic, genisteina si cianidina. Toti acesti compusi au puternice actiuni anti-oxidante si anti-cancerigene, unii dintre ei avand si proprietati anti-inflamatorii.

Toate aceste date vor sta la baza dezvoltarii modelelor celulare de contracarare a inflamatiei intestinale cu ajutorul extractelor de tescovina, modele care vor fi utilizate pentru indeplinirea obiectivelor etapei urmatoare a proiectului.

Faza 2/2016

Activitatea 2. Explorarea efectelor prebioticelor si probioticelor utilizand modele celulare (abordari in vitro)

Pornind de la datele obtinute in etapa anterioara, ne-am propus in aceasta etapa sa dezvoltam un model celular de contracarare a inflamatiei intestinale cu ajutorul prebioticelor (extract de tescovina) si al probioticelor selectate. Inducand inflamatia in celulele epiteliale intestinale CaCO-2 cu stimuli bacterieni (LPS), am urmarit efectul prebioticelor, al probioticelor sau al combinatiei dintre acestea asupra expresiei unor importanti mediatori moleculari ai inflamatiei.

Rezultate obtinute:

Analiza genetica a demonstrat ca adaugarea prebioticului la celulele pre-tratate cu LPS a dus la reducerea nivelului de ARNm pentru citokinele pro-inflamatorii in comparatie cu probele tratate cu LPS.

Rezultatele noastre au demosntrat ca extractul de tescovina bogat in polifenoli poate modula expresia genelor codificatoare pentru TLRs indusa de activarea cu LPS. Insa, pentru a avea o imagine de ansamblu, sunt necesare alte studii pentru a elucida efectele extractului de tescovina asupra moleculelor implicate in calea de semnalizare prin TLRs. Rezultatele prezentate mai sus au demonstrat capacitatea prebioticului (extractul de tescovina bogat in polifenoli) de a modula markeri importanti ai inflamatiei in celulele epiteliale intestinale CaCO-2. In continuare ne-am propus sa evaluam capacitatea extractului de tescovina combinat cu probiotice (Lactobacili sp) de a contracara inflamatia intestinala indusa de stimului bacterieni ca LPS (lipopolizaharidele din peretele bacteriei Escherichia coli).

Adaugarea extractului de tescovina in sistemul pre-stimulat cu LPS duce la scaderea cu 4% a sintezei de oxid nitric, in comparatie cu celulele tratate doar cu LPS. Combinatia dintre extract de tescovina (prebiotic) si amestec de Lactobacili (probiotic) adaugate peste celulele deja stimulate cu LPS scade cu 3% concentratia de oxid nitric, comparativ cu celulele CaCO-2 tratate cu LPS. Rezultatele prezentate mai sus sunt incurajatorare, indicand scaderea nivelului de NO indus de LPS de catre combinatia prebiotice si probiotice.

In bolile inflamatorii in general si in inflamatia intestinala in special apare o crestere caracteristica a permeabilitatii barierei epiteliale datorita expresiei deficitare a unor proteine care intervin in formarea si reglarea jonctiunilor intercelulare. Experimentele noastre au demonstrat ca tratamentul cu extract de tescovina bogat in polifenoli sau cu amestecul prebiotic+probiotic aplicat celulelor intestinale in care s-a indus inflamatia a crescut nivelul de expresie al genelor ce codifica pentru proteinele de jonctiune occludina si ZO-1. Acest fapt demonstreaza capacitatea amestecului de prebiotic+probiotic ales de noi de a restabili intergitatea barierei epiteliale intestinale, cu implicatii in reducerea amplitudinii procesului inflamator local.

Tehnologiile de tip membrane array furnizeaza informatii complete asupra statusului inflamator celular si permit o analiza mult mai larga a activitatilor proteinelor si posibilitatea de a descoperi noi actori cheie, mecanisme sau biomarkeri asociati cu semnalizarea in procesele inflamatorii. Cuplarea tehnologiei membrane array cu un sistem susbtrat ultrasenzitiv de detectie chemiluminiscenta si cu analiza spoturilor detectate pe membrane a permis vizualizarea semnalelor positive pentru un numar de 40 specii proteice diferite, toate implicate in inflamatie. Clasele functionale identificate in studiul nostru sunt dupa cum urmeaza: chemokine, molecule de adeziune, interleukine, receptori pentru formele solubile ale citokinelor, factori de crestere si receptori pentru matrix metaloproteinaze. Dintre aceste clase, tratamentul cu mixul prebiotic plus probiotic al celulelor pre-tratate cu LPS a modulat nivelul de expresie al chemokinelor (M-CSF, MIP-1a si RANTES), moleculelor de adeziune (ICAM-1), interleukinelor (IFN-?, IL-1, IL-3, IL-8, IL-12p70, IL-16, TNF-a, TNF-) si formelor solubile ale citokinelor IL-6 si TNF-a.

Dupa detectia chemiluminiscenta, membranele au fost supuse analizei densitometrice, cu ajutorul programului de specialitate ImageJ. Analiza statistica a datelor furnizate de tehnologia membrane array a demonstrat ca tratamentul concomitent cu prebiotic si probiotic aplicat celulelor CaCO-2 pre-tratate cu LPS a redus proportiile in care sunt afectate chemokinele (7,5%), interleukinele si receptorii pentru formele solubile ale citokinelor (5%) si moleculele de adeziune (2,5%), comparativ cu celulele in care a fost indus statusul inflamator.

Utilizarea tehnologiei membrane array pentru detectia simultana a 40 de mediatori inflamatori in cazul modelului in vitro de inflamatie intestinala a evidentiat rezultatele pozitive ale tratamentului concomitent cu prebiotic si probiotic al celulelor afectate.

Publicatii si comunicari
Articole publicate in reviste BDI

1. Effect of grape pomace extract enriched in polyphenols in counteracting intestinal inflammation by using an in vitro intestinal cellular model - Gina Cecilia Pistol, Daniela Eliza Marin, Ionelia Taranu; Scientific Papers-Animal Science Series: Lucrari Stiintifice - Seria Zootehnie, 2016, ISSN 1454-7368, vol 66 (21), pag 8-13

Nr. Crt.	Autori	Titlu	Tip	Conferinta	Observatii
1	Gina Cecilia PISTOL, Daniela Eliza MARIN, Ionelia TARANU	Effect of grape pomace extract enriched in polyphenols in counteracting intestinal inflammation by using an in vitro intestinal cellular model	Prezentare orala	Simpozionul stiintific international "Zootehnia Moderna - Siguranta Alimentara Si Dezvoltare Durabila"; Facultatea de Zootehnie, Universitatea de stiinte Agricole si de Medicina Veterinara "Ion Ionescu de la Brad" din Iasi, 20-22.10.2016	Premiul sectiunii stiinte fundamentale in cresterea animalelor
2	Mihai Laurentiu PALADE, Cristiano BELLO, Fausta NATELLA, Mona Elena POPA, Ionelia TARANU	Concentration dependent behaviour of polyphenol model solutions towards the inhibition of copper-mediated low density lipoprotein (LDL) oxidation	Poster	4th ISEKI_Food 2016 Conference - Responsible Research and Innovation in the Food Value Chain, Viena, Austria, 06-08.07.2016

Alte rezultate obtinute:

Proiectul TE 302 sta la baza unei propuneri de Cooperare Bilaterala Romania - Comunitatea Valona-Belgia. Titlul propunerii, aflate in stadiul de evaluare stiintifica, este Efectul prebioticelor si probioticelor asupra microbiotei si proceselor intestinale la porc ca model pentru maladiile inflamatorii intestinale umane, acronym MetaGutPig, in colaborare cu Universite de Liege, Gembloux Agro-Bio Tech, Departement AgroBioChem.

http://uefiscdi.gov.ro/userfiles/file/PNCDI%20III/P3_Proiecte%20mobilitati/Ro-Belgia%20-%202016/Lista%20de%20propuneri%20eligibile%20administrativ%20BE%202016.pdf